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第1篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

關鍵詞：表觀遺傳學 教學 研究生

中圖分類號研究生教育是高等教育的重要組成部分，是培養高素質、高層次人才的重要手段。今天的社會對研究生的全面素質和創新能力提出更高的要求，而專業課教學是研究生教育的最基本部分，是提高研究生專業素質和創新能力的直接途徑，因此，提高專業課教學水平對研究生的培養具有十分重要的意義[1]。隨著生物技術和醫學科學技術的迅速發展，知識更新速度加快，學科之間相互交叉、相互滲透，邊緣學科和新興學科不斷涌現。表觀遺傳學是近幾年來生命科學迅速發展的前沿學科之一，其理論與技術已經廣泛滲透至生物學、基礎醫學、臨床醫學及預防醫學的各個學科。表觀遺傳學是我們學院學術型碩士研究生專業課程和專業學位碩士研究生專業知識模塊的主干課程。如何適應新形勢下研究生培養的需要，筆者主要針對研究生表觀遺傳學教學談一些自己的看法及建議。

1 教師業務素質的提高

生物醫學模式的轉變對教師的業務素質和能力提出了相應的更高要求。不僅要求教師有生命科學、基礎醫學和臨床醫學的專業知識，而且還要有生物醫學理論方面的知識，同時要求教師的技術知識層次能跟上生物醫學實驗技術推廣周期不斷縮短的趨勢。我們在研究生的表觀遺傳學教學中，隨時進行文獻調研，密切關注最新高水平期刊和學術會議的相關信息，不斷補充傳達的最新知識。引導學生關注當前研究活躍的腫瘤、衰老、心血管疾病、感染性疾病與表觀遺傳學的最新研究進展情況，著重介紹營養、環境、應激、細胞代謝在表觀遺傳變化中的重要作用機制。這些新知識非常受研究生的歡迎，引起他們濃厚的興趣。通過這些新知識的學習，不僅開闊了研究生的學習視野，啟發了他們的創新思維，同時使他們形成良好的文獻調研和學術研討的習慣，逐步形成和掌握正確的科研方法，為即將開展的課題研究工作奠定了堅實的基礎。在教學過程中反過來能進一步促進教師知識結構的不斷更新，達到教學相長的目的。

2 改革教學內容，形成完整的表觀遺傳學知識結構體系

與經典遺傳學以研究基因序列決定生物學功能為核心相比，表觀遺傳學主要研究基于染色質事件對于這些“表觀遺傳密碼”的建立和維持的機制，及其如何決定細胞的表型和個體的發育。在表觀遺傳學研究生課堂教學過程中必須具有一定的前瞻性，引導研究生關注表觀遺傳學學科的發展動態，密切注意學科的交叉和延伸，緊跟表觀遺傳學的發展方向和學科發展的突破點。課堂教學過程中把最主要的精力放在表觀遺傳學學科領域發展最活躍最富潛力的研究方向上，例如表觀遺傳機制在癌癥等疾病中的作用機制，細胞代謝與表觀遺傳變化的關系等。表觀遺傳學是生命科學中一個普遍而又十分重要的新研究領域。它不僅對基因表達、調控、遺傳有重要作用，而且在腫瘤、免疫、病毒感染復制等許多疾病的發生和防治中亦具有十分重要的意義。在教學過程中主要內容包括：表觀遺傳學概論，DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質重塑，基因組印記，X染色體失活，siRNA與miRNA介導的調控，表觀遺傳學與疾病，表觀遺傳學與癌癥，天然產物及中草藥的發展對表觀遺傳學的展望，表觀遺傳學的治療進展。上述內容形成完整的表觀遺傳學知識結構體系。在教學過程中，通過有選擇地插入一些小型專題講座及相關的研究歷史背景資料的方式，介紹和強調學習和掌握表觀遺傳學的重要性，既活躍了課堂，又把課程從枯燥的理論講解中解放出來，同時激發了研究生的學習積極性，拓寬相關的知識面[2]。同時在教學過程中注重前沿進展內容的加入，如代謝、營養、環境等影響因素與表觀遺傳學的相關進展。

3 改革教學方法，培養研究生的創新能力

本課程所授課的對象是已具備一定自學能力和學習主動性的研究生，最重要的是培養他們科學地發現并解決問題的能力、準確表達個人思想見解的能力以及科研創新能力。本課堂選課人數一般在十人左右，因此課堂教學的特點在于小班授課。由于是小班教學，增加了教學的靈活性和增強了師生之間互動的可能性，師生之間的交流與溝通增多。因此在教學過程中采用教師課堂授課、學生參與研討、學生講授等多種教學方式，強調講授、研論、文獻調研、學術講座、論文報告、文獻綜述等多種方式并重的原則。在教學過程中，合理安排時間，讓研究生充分參與到教學的研討，結合自己的研究方向發表自己獨特的見解，闡述自己的學術觀點，這種教學方式為研究生迅速進入科研工作的角色奠定了堅實的基礎，增強了研究生創新能力的培養。發揮現代多媒體技術在教學中的重要作用，電子課件與板書相結合，同時采用圖片、視頻播放、動畫等多種方式的應用。倡導啟發式教育，摒棄灌輸式教學方法，講授基本理論知識的同時注意結合科研最新進展情況拓寬學生知識面，加強學生創新能力的培養，使學生的理論基礎和實踐應用能力同步得到提高，取得了較好的教學效果。對由于受學時限制而不能在課堂上詳細介紹的前沿內容可使用討論法，安排學生課后自學，啟發學生提出問題，通過課堂討論得到解決。還可以在部分單元結束后，要求研究生根據自己的專業方向，結合查閱最新的文獻資料，撰寫小專題報告，組織交流討論，以便鞏固學生所學知識，并進一步拓寬知識面。研究生不同于本科生，他們有強烈的求知欲孥，有較高的學習熱情，有較強的自學能力，所以在教學中倡導自學，組織討論，是因材施教、培養研究生創新能力的好方法。

4 多種考核方式結合，檢驗教學效果。

在研究生的考核方面，不僅僅局限于對課內授課內容的掌握程度，還可以采用綜述、專題小報告、PPT匯報、模擬課題設計等綜合考核方式，注重知識的活學活用和創新意識的培養，這樣才有利于研究生即打好廣博、堅實的理論基礎，又能其重組知識框架，只有這樣，研究生的創新意識才能夠得到增強。

研究生創新能力培養是受多因素復雜交錯影響的，要提升研究生的創新能力，既要保證培養研究生的客觀條件充足，又要發揮研究生的主觀能動性。研究生教育只有適應知識經濟時代的要求，才能不斷培養出符合社會需要的高層次創新型人才。表觀遺傳學既是目前迅速發展的學科和熱點領域，在生物醫學各種學科存在著千絲萬縷的聯系。它也是我們學院研究生重要的專業基礎課，對于培養研究生的創新意識，培養研究生發現問題、解決問題的能力具有重要的作用。只有在教學實踐中不斷地提高教師自身素質，調整教學內容，改進教學方法，才能達到預期目的。

參考文獻

第2篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

關鍵詞 去甲基化藥物 表觀遺傳學 血液系統腫瘤

中圖分類號：R979.1； R733 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）11-0003-04

Application of demethylating agents in the treatment of hematologic malignancies

Zhao Min*， Wang Chun**

（Department of Hematology， Shanghai First People’s Hospital， Shanghai 200080， China）

ABSTRACT Epigenetic dysregulation is linked to the pathogenesis of a number of malignancies. The methylation of DNA plays an important role during the maliganant transformation of hematopoietic malignancies since it can inhibit the expression of tumor suppressor genes. Demethylating agents have been successfully used in the treatment of various hematopoietic malignant disease， especially in the treatment of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. In this review， we discuss the clinical development of demethylating agents in hematology.

KEY WORDS demethylating agents； epigenetics； hematologic malignancies

近年來，去甲基化藥物在血液系統腫瘤治療中的作用越來越受到重視。與傳統化療藥物相比，去甲基化藥物的毒、副反應相對較輕，加之作用機制不同，治療骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes， MDS）和急性髓細胞性白血病（acute myelocytic leukemia， AML）等的療效更好。

1 去甲基化藥物

去甲基化藥物治療的理論基礎是表觀遺傳學。后者是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化并最終導致了表型的不同。表觀遺傳學對由DNA決定遺傳特征（由DNA到RNA、再到蛋白質進行表達）的“中心法則”作了補充，指出生物的遺傳特性在不改變其基因序列的情況下也會發生變化，而這種變化在腫瘤的發病機制中已一再被檢測到。現在認為，決定表觀遺傳學過程的主要因素包括DNA修飾、組蛋白修飾和非編碼RNA調控。DNA甲基化是一種最為重要的表觀遺傳學修飾，在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase， DNMT）的催化下，胞嘧啶的第5位碳原子被甲基化，從而轉變為5-甲基胞嘧啶。在哺乳動物基因組中，DNA甲基化的主要位點是CpG二核苷酸，它在基因組中呈不均勻分布。在某些區域，CpG序列的密度較平均密度高10 ～ 20倍、鳥嘌呤和胞嘧啶的總含量>50%、長度>200個堿基，這些區域被稱為CpG島。大約50%的人基因中含有CpG島，常位于基因上游調控區的啟動子區。啟動子區的CpG島通常處于非甲基化狀態，基因能正常表達。當CpG島發生甲基化時，會影響基因轉錄調控，使基因表達發生沉寂。而去甲基化藥物能改變這一病理過程，進而達到治療目的[1]。現有去甲基化藥物主要為DNMT抑制劑，可分為核苷類和非核苷類2類，其中核苷類去甲基化藥物中的阿扎胞苷和地西他濱是目前臨床應用較廣且以去甲基化為主要作用機制的藥物。

2 在血液系統腫瘤治療中的應用

2.1 治療MDS

在MDS的治療中，去甲基化藥物的作用越來越受到重視。近年來多項研究證實，MDS的分子異常包括DNA甲基化等表觀遺傳學進程，如CpG島的高甲基化和基因啟動子區的甲基化即與MDS的嚴重性和患者的生存期相關，而使用去甲基化藥物治療雖不能治愈MDS，卻可獲高反應率。與需要且可接受造血干細胞移植術的年輕患者相比，去甲基化藥物更適宜用于老年患者，這主要表現在血液學參數改善和生存時間延長上，因即使沒有達到完全緩解的患者也同樣能夠獲得這些益處[2]。地西他濱用于老年患者的安全性已得到多項臨床試驗的確認，而被認為無骨髓毒性的阿扎胞苷亦被證實對老年患者有很好的療效和安全性，對需接受造血干細胞移植術的患者也一樣。有人建議將地西他濱和阿扎胞苷用于“先期治療”，但這種“橋接治療”的必要性還待更多研究的證實[3]。在治療MDS時，去甲基化藥物的療效多需在治療2 ～ 4個療程后才逐步顯現，終止治療后則會導致疾病復發[4-5]。即使不間斷地接受去甲基化藥物治療，幾乎所有的患者也仍難以避免疾病的耐藥和復發，而一旦出現疾病耐藥或復發就會大大縮短患者的生存期[6]。

目前，MDS患者可通過國際預后評分系統（International Prognostic Scoring System， IPSS）、國際預后評分系統修正版和世界衛生組織的預后評分系統進行分層，這對恰當地使用去甲基化藥物具有實際指導意義。對IPSS評分為低危和中危-1的患者，減少的血細胞類型、促紅細胞生成素濃度以及細胞遺傳學、分子生物學異常如5q、DR-15等生物學特征是選擇恰當的一線治療藥物的依據，去甲基化藥物主要用于輸血依賴的、經促紅細胞生成素等藥物一線治療后復發或耐藥患者的后續治療。也有人提出應使用阿扎胞苷一線治療主要表現為血小板減少和中性粒細胞減少的低危MDS患者。一些臨床試驗結果顯示，地西他濱或阿扎胞苷治療低危MDS患者的總反應率為30% ～ 60%。對IPSS評分為中危-2和高危的患者，去甲基化藥物已用于一線治療，可使患者獲得較高的總反應率和較長的總生存期，且毒性明顯較低。在臨床試驗中，地西他濱或阿扎胞苷單藥治療高危MDS患者的總反應率為40% ～ 55%。但異體造血干細胞移植仍是可治愈MDS的唯一選擇[2，7]。目前尚不能完全預測去甲基化藥物治療的療效。骨髓增生異常法語工作組建立了一套預測模型以預測去甲基化藥物治療的總反應率、反應持續時間和總生存期，同時提出先期使用低劑量阿糖胞苷、骨髓原始細胞占比>15%以及異常核型與反應率相關，復雜核型與反應持續時間相關，總生存期與體能狀態等因素相關，并建立了積分系統[8]。也有報道稱，骨髓纖維化的出現對去甲基化藥物治療不利[9]。

2.2 治療AML

去甲基化藥物現已在AML治療中占有重要地位。AML患者廣泛存在基因高甲基化現象，常見的甲基化基因有8種，約95%的AML患者至少有1種基因高度甲基化，75%至少有2種基因高度甲基化。這些數據提示去甲基化藥物在AML治療中的潛力，但其同樣被認為無法治愈AML。目前，經典的蒽環類藥物和阿糖胞苷聯合誘導化療方案仍是AML的首選誘導化療方案，且造血干細胞移植術仍是AML的最主要治愈性治療手段。但對一些難以接受常規誘導化療方案和造血干細胞移植的患者如老年AML患者，去甲基化藥物因相對較低的毒性和較好的療效已經成為重要的治療藥物。地西他濱已獲準治療這類AML患者，常用治療方案為20 mg/（m2?d）×5 d。臨床試驗證實，地西他濱治療的反應率優于支持治療和低劑量阿糖胞苷；也有臨床試驗顯示，地西他濱治療可獲較之支持治療更長的生存期。但與常規誘導化療方案不同，去甲基化藥物治療AML往往需要進行多個療程后才能達到完全緩解且此療效無法持久維持[10]。近期國內報道，地西他濱聯合阿柔比星、粒細胞集落刺激因子等治療初治及難治/復發AML的療效較好；也有地西他濱聯合硼替佐米治療的報道。盡管去甲基化藥物已用于AML治療，但其不能治愈疾病，對那些治療有效患者的后續治療選擇也還處在摸索階段。有關研究證實，某些分子學和細胞遺傳學參數與患者對地西他濱治療的反應有關。例如，有人發現，對地西他濱治療有反應患者的DNMT miR-29b水平明顯高于無反應患者[11]。一項回顧性分析顯示，伴有5和7號染色體異常的患者對阿扎胞苷或地西他濱治療的反應與對大劑量伊達比星和阿糖胞苷治療相似，且患者的持續反應時間和中位生存期也更長。DNMT 3A基因突變為AML的獨立的預后不良指標，不受患者的年齡、白細胞計數、染色體組型和其他遺傳學參數的影響[12]。但利用細胞遺傳學和分子生物學參數來預測患者對去甲基化藥物治療的反應尚處在探索階段，現還只能通過患者的病程、腫瘤增殖程度和一些臨床指標來作治療前評估。

2.3 治療慢性粒單核細胞性白血病（chronic myelo-monocytic leukemia， CMML）

造血干細胞移植術也是CMML的治愈性治療手段。但由于年齡和并發癥等原因，CMML患者往往只能接受低劑量化療治療，無法有效控制疾病進展。在CMML患者中發現存在細胞周期調節基因p15（INK4b）的異常甲基化以及降鈣素基因和細胞信號轉導抑制因子-1基因的甲基化，這給對CMML進行去甲基化治療提供了一定的理論基礎。一項對31例CMML患者進行的臨床試驗顯示，以每6周為1個療程、每療程使用地西他濱15 mg/（m2?次）×3次/d×3 d治療1 ～ 6個療程，總反應率為26%（完全緩解率10%、部分緩解率16%），骨髓改善率為19%，疾病穩定率為32%，2年生存率為25%，所有患者的中位生存期為15個月[13]。與治療MDS和AML相似，地西他濱在近年來進行的一些臨床試驗中也不再以大劑量使用。一項臨床試驗以每28 d為1個療程、每療程使用地西他濱20 mg/（m2?d）×5 d治療CMML患者共3個療程，結果發現總反應率為38.6%，2年總生存率為48%，中位無進展生存期為12個月，3/4級不良反應為血細胞減少、感染和乏力[14]。

2.4 治療其他血液系統腫瘤

對慢性粒細胞性白血病、多發性骨髓瘤等亦有使用地西他濱等去甲基化藥物治療的研究報道，但療效尚待進一步臨床試驗的證實。

3 結語

DNA甲基化異常被認為是血液系統腫瘤發生、發展的一個重要生物學機制，一些臨床試驗也已證實去甲基化藥物治療某些血液系統腫瘤的療效確切，但仍需對如聯合用藥和最適治療劑量等作進一步的研究，以期獲得更好的治療療效。

參考文獻

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第3篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

[關鍵詞] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06

Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer

GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping

Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.

[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為最常見惡性腫瘤之一，其發病率僅位于肺癌和前列腺癌（女性為乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率約占全部惡性腫瘤死亡總人數的8%，在惡性腫瘤死因中居第4位[1]。CRC的發生與發展與癌基因和抑癌基因的缺失、擴增或突變有關。有些基因在染色質水平上發生表型遺傳修飾改變也會導致表達下調。表型遺傳修飾最多見的是CpG島（CpG island）的甲基化改變。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人類染色體12q14.3上，由10個外顯子組成，全長約200 kb。Wnt/β-catenin信號傳導通路是調控細胞生長增殖的重要途徑之一，其異常激活已發現與多種人類腫瘤密切相關[2]。Wif-1基因是這條通路的下游區基因也是這條通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多種腫瘤中都已證實是存在的，它作為一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其啟動子的高甲基化參與了腫瘤的發生發展。本實驗通過研究5'-氮雜-2'-脫氧胞苷（5'-Aza-CdR）對HT-29和LoVo細胞株作用后Wif-1基因的DNA層面、mRNA層面和蛋白層面的改變，探討腫瘤發生發展過程中Wif-1基因失活的甲基化機制及藥物恢復Wif-1基因表達的可能性，以期尋找CRC的腫瘤標志物及新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo（北京大學醫學部107實驗室）；DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；核酸蛋白質濃度測量儀B-500（上海創萌生物科技有限公司），DNA甲基化修飾試劑盒及甲基化陽性/陰性對照（美國ZYMO公司）；qPCR反應試劑ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海輝睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR擴增儀（美國Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美國Sigma公司），以DMSO溶劑充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分裝后-80℃保存；Wif-1和內參β-actin（美國Santa Cruz公司），Western blot相關試劑（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 細胞培養和干預

結直腸癌細胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640的培養基中常規培養，胰酶消化傳代。取貼壁生長良好的細胞以RPMI1640調整細胞密度至2×106/mL，接種于六孔培養板。干預的LoVo和HT-29細胞分別加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培養液，每24小時更換新鮮培養基，連續作用72 h；以HT-29和LoVo分別加入等量DMSO溶劑培養作為對照（0 μmol/L）。

1.3 Methylight方法

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）說明提取上述兩種細胞不同濃度梯度的細胞DNA，用紫外分光光度儀（上海創萌生物科技有限公司）測DNA濃度，以DNA濃度在25 ng/μL為最低濃度，使用DNA修飾試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾，按照試劑盒說明書操作，Wif-1基因甲基化引物和探針設計：Wif-1基因序列參照GenBank。甲基化引物和探針由Beacon Designer 7.9軟件設計，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探針：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，內參β-actin基因甲基化按文獻[3]設計，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探針：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反應總體系為20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修飾后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探針FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50個循環；72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。經亞硫酸氫鹽修飾的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作為陽性、陰性對照，水為空白對照。

1.4 實時熒光定量PCR分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，胰酶消化后抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，行實時熒光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0軟件設計，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；內參基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反應體系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反應條件為95℃預變性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40個循環；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。實驗重復3次，取均值。擴增完畢后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表達。ΔΔCt=（Ct處理組目的基因-Ct處理組內參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因）。

1.5 Western blot分析結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表達情況

取對數生長期的HT-29和LoVo細胞，在上述兩種細胞株各個濃度梯度的每管細胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制劑PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃離心，10 min后取上清液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。總蛋白100℃變性5 min后，配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，進行蛋白質電泳，蛋白電泳分離后經電轉移槽轉移至PVDF膜。BSA室溫封閉2 h后，PVDF膜置于1∶200稀釋的Wif-1單克隆抗體稀釋液中4℃冰箱內培養過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG稀釋液中37℃培養2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL發光液顯影，采集并分析處理圖像。凝膠成像系統攝像并分析各條帶吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）為基準，設置為1。以目的基因條帶吸光度值（A）/β-actin條帶吸光度值（A）作為Wif-1蛋白的相對表達強度。實驗重復3次，取其平均值。

1.6 MethyLight結果判斷標準

同時擴增目的基因（Wif-1）和內參基因（β-actin），根據標準曲線得到兩者的原始拷貝數，計算標準甲基化指數（the normalized index of methylation，NIM）。其定義為：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，Wif-1 positive指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin sample指樣本中甲基化Wif-1基因的拷貝數，β-actin positve指陽性對照中甲基化Wif-1基因的拷貝數。NIM≥4為甲基化，NIM

1.7 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），行配對t檢驗，并設定P值為雙側分布，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化狀況

將陽性對照按10的倍數稀釋成1×100～1×10-6 7個濃度梯度制作標準曲線（其拷貝數為103～109/mL）。各濃度梯度反應均做復孔。MethyLight的線性范圍為104～108拷貝/mL，R2為0.907。實時熒光定量PCR得出數據按MethyLight結果判斷標準，在DMSO對照組、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。見表1、圖1。

表1 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀況

2.2 結直腸癌細胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表達狀況

實時熒光定量PCR得出的數據檢驗擴增效率（E）通過公式E=2-1/斜率-1計算，Wif-1基因mRNA為0.945，GAPDH基因mRNA為0.977，兩個基因的擴增效率相差

表2 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1基因mRNA表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

2.3結直腸癌細胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表達狀況

Western blot結果運用Image J軟件進行條帶圖像分析，獲得HT-29和LoVo細胞株各條帶光密度值，并計算出兩種細胞在各組中的平均光密度比值，進行半定量分析及統計學分析，并以各實驗分組為橫坐標，將測出相應的平均光密度比值為縱坐標，繪出柱狀圖后發現0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。見表3、圖3。

表3 HT-29和LoVo細胞株中Wif-1蛋白表達狀況（x±s）

注：與DMSO對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

A：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；B：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中HT-29細胞株Wif-1蛋白柱狀圖；C：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白Westernblot條帶圖；D：DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組中LoVo細胞株Wif-1蛋白柱狀圖

圖3 各組HT-29細胞株及LoVo細胞株Wif-1蛋白表達

3討論

CRC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，每年全球新發病例達123萬，病死率約為發病率的1/2。我國CRC發病率雖低于西方發達國家，但近20年來CRC的發病率仍在逐漸上升，同時，其發病年齡有增高趨勢。近年研究表明CRC的發病是多因素、多階段、多基因連續累積發生的過程，除遺傳學改變外，表觀遺傳學改變亦參與CRC的發生、發展過程。表觀遺傳學是指不涉及DNA序列改變，但基因表達卻發生可遺傳的改變，DNA甲基化、組蛋白修飾、MicroRNA等是表觀遺傳學的主要形式。與腫瘤發生關系最密切的是DNA甲基化修飾異常，其中包括基因組去甲基化及部分區域高度甲基化兩種形式。DNA甲基化可以導致癌相關基因沉默，病變迅速進展為癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能認識CRC中基因異常DNA甲基化，將可能獲得CRC診斷的腫瘤標志物及新的治療靶點[5-7]。

經典Wnt/β-catenin信號通路發現迄今已數十年，作為一條高度保守的信號通路在動物胚胎的器官發育各個階段均發揮異常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信號傳導通路的拮抗基因之一，屬SFRP拮抗家族，在種族間高度保守，最早在人類視網膜中發現[8]。它主要通過捆綁Wnt信號蛋白，阻止其與Frizzled受體相互作用，從而抑制通路的異常激活。Nosho等[9]的研究發現，在早期CRC中伴有Wif-1表達的下調，可能通過引起經典Wnt/β-catenin信號通路的激活，導致通路下游靶基因的過度表達，伴隨細胞過度的增殖和失控的分化從而引起腫瘤的發生。表觀遺傳學改變如基因5′端CpG島甲基化是Wif-1基因失活的重要機制。已有一系列研究證實在各系統腫瘤中，啟動子區甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究顯示，Wif-1啟動子區的甲基化率都很高，分別為82.0%和74%。齊健等[15]的研究結果與國外基本一致，Wif-1甲基化率為84.7%。Wif-1基因的啟動子中存在T細胞相關因子（T cell factor，TCF）的反應元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核內靶因子，Wnt信號活化可使β-catenin在胞漿內累積并進入核內識別淋巴結增強因子/T細胞相關因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等轉錄因子，激活Wnt信號的靶基因，控制胚胎發育及細胞生長、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究結果顯示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在細胞質中的積聚及經典Wnt/β-catenin信號通路的激活。

本實驗研究中筆者采用去甲基化藥物5'-Aza-CdR處理兩個結直腸癌細胞株：MSS細胞株HT-29和MSI細胞株LoVo后通過實時熒光定量PCR檢測，筆者發現DNA層面上DMSO對照組，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29細胞株中Wif-1基因甲基化狀態分別為甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo細胞株中Wif-1基因甲基化狀態都為未甲基化，說明去甲基化藥物5′-Aza-CdR能夠逆轉Wif-1基因甲基化狀態，同時在mRNA層面上筆者發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=144.823，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有統計學意義（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo細胞株中Wif-1基因的mRNA表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=476.195，P=0.000），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差異均有高度統計學意義（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通過Western blot在蛋白層面上發現在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29細胞株中Wif-1蛋白表達水平較DMSO對照組上調，并且有時間、藥物濃度依賴性（F=129.674，P=0.000），與DMSO對照組比較，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組比較，差異均有統計學意義（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo細胞株中Wif-1基因的蛋白表達水平較DMSO對照組略微上調，并且有藥物濃度依賴性但差異無統計學意義（F=0.117，P=0.948），與DMSO對照組比較，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR組差異均有高度統計學意義（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。

本實驗研究顯示甲基化酶抑制劑5′-aza-dC可通過啟動子甲基化而失活的Wif-1基因的異常甲基化狀態得到逆轉，而使該抑癌基因恢復其轉錄活性，以使該基因在腫瘤的發生發展中發揮可能的抑制腫瘤的作用。腫瘤的發生發展涉及多種途徑和多種基因的改變，其中表觀遺傳學的變化逐漸受到醫學研究的重視。異常甲基化是表觀遺傳學研究的一個重要內容，往往是導致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通過對異常甲基化的進一步研究，來尋求結直腸腫瘤診斷的新標志物和治療的新靶點。

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第4篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

關鍵詞：分子生物學；課程教學；改革研究；創新生物學人才

分子生物學的目標是在分子水平上闡明細胞活動的規律，從而揭示生命的本質[1]。雖然它在生物類專業課程體系中充當著重要角色，對生命科學的發展起著至關重要的作用，但是分子生物學的教學卻因為課程內容多，學科交叉廣，理解難度高，信息量大，知識更新快而使教學效果差強人意，集中表現為教師授課難和學生學習難。這種現狀不但困擾著老師和同學，也與大學培養高素質創新型人才的目標不相適應。如何克服分子生物學課堂教學的“瓶頸”？本人在從事十多年的分子生物學教學過程中，努力研究和探索多種形式的教學改革，力求提升教學效果和教學質量。

一、教學內容的合理組織

分子生物學的教學除了選用好的教材，制定完善的教學大綱，如何組織教學內容是教學的一個非常重要環節[2]。教學內容呈現給學生的應該是完整、清晰的、有層次、條理的知識。我們在組織教學的過程中，首先從提高自身學科素養著手。“一本教材書，數種參考書”，除分子生物學國內、國外各類版本外，與分子生物學相互交叉和滲透的其他學科，如細胞生物學、生物化學、遺傳學，我們也都進行了系統的學習和強化，不斷夯實專業知識、拓展專業領域，基本構建了分子生物學完整的知識體系，具備了對教材處理的前提。既避免了教學中各學科的重復，也進一步凝練了知識。此外，我們還通過網絡教學平臺向全國優秀教師學習，在不斷的探索中總結出了教學內容合理組織的一些思路。1.思維導學模式。在DNA復制教學環節，知識點多，并且較分散，很容易在教學中造成學習困難和知識混淆的現象，針對這章教學的特點，我們采用了思維導學模式，收到了非常好的教學效果。2.重點、難點解讀。本科教學形式多樣化，也更提倡學生的自主學習，但并不是淡化了教師的教學，反而對教師提出了更高的要求[3]。教師必須圍繞每堂課的教學目的，合理組織和引導學生理解并掌握教學的重點和難點內容。比如在講解染色體端粒末端修復機制中，教師首先要從教材的知識結構中梳理出重點。染色體端粒末端修復機制的知識點包括：（1）引物切除造成的遺傳信息缺失；（2）端粒末端的特點；（3）體細胞和性細胞末端修復機制的不同；（4）DNA結構的變化；（5）端粒酶的修復機制。梳理知識點后，總結教學重點：一是引物切除后損傷修復在體細胞和性細胞中的不同；二是四鏈DNA結構；三是端粒酶的修復機制。其中端粒酶修復機制的講授是學生學習的難點。難點集中在端粒酶的性質和修復發生的過程。經過對教學內容中重點和難點的準確把握和合理組織，教師才能在課堂教學中突出重點、突破難點，讓學生的課堂學習無障礙。

二、教學方法和手段的改進

教學方法的推陳出新，是教學改革的重要內容[4]。為發揮學生作為教學主體的能動性，我們根據具體的教學內容設置了啟發式、聯想式、探究式等多種教學方法[5]，讓學生參與到教學過程中，不僅活躍了課堂氣氛，而且在分享知識的同時，更注重教會學生靈活掌握學習的方法。

1.啟發式教學。啟發的目的在于舉一反三，觸類旁通。針對每一次的課堂教學，設計一些拋磚引玉的問題，供學生思考與討論，這成為了分子生物學理論教學的重要組成部分。如進行到真核生物基因表達調控學習環節，提出甲基化修飾的生物學意義，這個問題覆蓋范圍廣，涉及到了DNA復制的調節、蛋白質和DNA甲基化修飾對基因表達的調控，以及Epigenetic（表觀遺傳學）方面的知識。通過提出問題—討論分析—不斷啟發—再討論分析—歸納總結—解決問題這一系列的互動教學活動，充分調動了學生課堂學習的主動性和積極性，在不斷的討論分析中通過展示不同的思維、發表各自的觀點，不但有利于促進學生在學習中發現問題、解決問題，而且有利于學生通過對基礎知識的消化、理解來達到理論的升華、拓展[4]。

2.聯想式教學。分子生物學是在生物化學、細胞生物學和遺傳學的基礎上發展而來[6]，因此知識相互交叉、相互滲透。在授課的過程中，教師一方面要避免重復，一方面要通過聯想知識點適時培養學生的發散性思維，提高學生對知識的遷移能力和整合能力。如在講解化學修飾對基因的表達調控時，將細胞生物學中的信號轉導有機結合，使學生了解基因表達調控對細胞信號轉導的作用機制。

3.探究式教學。在分子生物學教學中，每一個理論知識的背后都是科學研究的重大突破。如確定遺傳物質是DNA的兩大經典實驗，我們以探究的形式呈現教學內容，從實驗設計，到結果顯示，再經過討論分析并得出結論，以課題研究的角度，研究人員的身份引導學生進入學習角色，將學科概念、理論產生的起因和過程展示給學生，啟發學生努力探索，走近科學，讓學生從中領悟知識形成的探究性和科學性，逐漸培養具有創新意識和能力的高素質研究型人才。4.多媒體多樣化教學。分子生物學的教學內容具有微觀性、復雜性、抽象性和動態性。傳統的教學手段無法滿足教學的需求，而多媒體技術則具有聲像俱佳、動靜皆宜的特點[7]，是傳統教學無法比擬的。多年來我們不斷補充和完善教學手段，逐漸形成了獨具特色的多媒體教學課件。多媒體圖像處理清晰直觀，文字表述簡潔明了、主題突出。課件中的圖像來源于國內外的網絡數據平臺。如講述DNA半保留復制機理時[8]，首先將DNA可能存在的幾種復制方式用圖像展現，并利用Meselson和Stahl設計的DNA復制同位素示蹤實驗和密度梯度離心實驗來進行結果驗證，引導學生明確掌握DNA半保留復制特點，并結合文字，通過圖文并茂的多媒體課件，將教學內容中的背景知識、基本概念、基本理論，以及靜態、抽象的微觀知識清晰講解。多媒體課件動靜結合、聲像互動。對于生命過程中動態的知識點，比如DNA的復制、RNA的轉錄、蛋白質的翻譯過程，可以將這些復雜的生命過程利用多媒體手段做成動畫并配以文字和聲像，形象直觀地展現給學生，既加深了學生對知識的理解，也提高了其學習效率。

三、知識領域的拓展

分子生物學的教學內容除包含基礎理論知識外，還有大量理論應用的研究方法部分。我們在教學中不僅僅將知識局限在教材中，利用課堂教學不斷引導學生去了解本學科相關領域內的研究熱點、最新進展、發展趨勢[8]，以及生物技術在生產實踐中的廣泛應用。

1.專題講座與專題討論。專題講座是教師根據教學內容，自己組織參考資料對教學內容的延伸與拓展。比如在講授“SNP技術”時，先從遺傳標記分析的發展著手，把一代、二代的標記分析做知識性的回顧，再將納入教材的第三代標記分析“SNP”做詳細的講解，引導大家理解什么是單核苷酸多態性，核苷酸多態性研究的生物學意義以及在醫學、農業、畜牧等多種領域的發展與應用。通過這種方式激發了學生的學習熱情和求知欲，也使教師不斷地進行知識的更新，及時了解本學科當前發展的趨勢、研究的熱點以及爭論的問題。專題討論則是以學生為主體，根據課程教學內容，組織學生就某一個專題自行查閱、組織文獻資料，并在課堂上展開討論[9]。比如在講授基因重組的教學內容時，設計“轉基因的利與弊”供學生討論。引導學生思考基因工程藥物和轉基因動植物對社會產生的巨大影響，讓知識離開課本走進生活，從而喚起學生學習的興趣和探索未知領域的欲望。這不僅使學生更加深入、系統地理解所學知識，并且培養了學生靈活運用知識的能力[10]。

2.生物信息技術與數據庫。生物信息技術已經發展成為分子生物學研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技術”的專題講座中，不僅要對實驗目的、原理、操作以及應用進行講解，還要特別對引物設計的生物信息技術進行補充，介紹學生對一些常規的生物信息技術軟件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAS-tar、Cluster等有一個基本的認知度。在整個分子生物學的教學中，學生需要自行查閱和組織各種文獻資料，因此，必須特別強調互聯網資源運用的重要性。教師通過介紹中國知網、維普、清華同方、NCBI等幾個常用資源庫，使學生了解如何利用資源庫進行查詢，對互聯網資源的熟練應用使學生的知識體系得以完善，學生通過自身的努力來提高信息收集和辨別的能力，培養了學生的自學能力。

四、教學改革中應該注意的問題

1.教師的專業修養與教學基本功。教師在教學中具有雙重身份，既是一名導演，又是一名演員。作為導演，首先需要有最新的教學理念，整個教學過程中適時設問、適時討論、適時啟發。其次要有較強的課堂組織能力，根據學生的學習情況，把握課堂節奏，調動學生課堂學習激情，使教學有的放矢。否則會在教學中出現“啟而不發”和論證條理不清的現象；作為演員，還要有良好的課程駕馭能力，通過教師扎實的專業知識、廣泛的認知領域、全面的知識結構，呈現給學生的是一個豐盛的知識大餐，而不是一鍋夾生飯。因此作為教師，必須從理論水平、科研水平、思維水平這3個方面提高教師自身的專業素質，此外，還要掌握適合自己的各項教學技能。

2.多媒體教學的合理應用。多媒體教學只是一種提高教學效果的輔助手段，是為教師的教學和學生的學習服務的，只有運用合理才可能達到好的效果。因此盡量避免在多媒體教學課件上出現過多的文字，否則多媒體成了教學活動中的主體，老師由照本宣科轉變為扮演放映員和播音員的角色。學生的學習興趣不高，教學效果也就適得其反。多媒體和傳統教學只有合理地結合，取長補短，才能在課堂教學中體現出其真正的價值。總之，教學改革的目標是幫助學生建立學科知識體系，培養學生良好的科學素養，提升學生后繼學習的能力。正如葉圣陶先生所說：“教師的教學，不在于給學生搬去可以致富的金子。而在于給學生點金的指頭。”目前，我們關于分子生物學課堂教學改革還處于不斷探索和實踐階段，除了需要不斷地提高教師自身的學科修養和科研素質外，也以“夯實基礎、拓展知識、增強能力、提高素質”[8]作為教學的目的和人才培養目標，努力在今后把教學工作開展得更加有生有色，為社會培養更多高素質創新型人才。

作者:武曉英 喬宏萍 張猛 吳麗華 郝雪峰 單位:太原師范學院

參考文獻：

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[2]戚曉利，張麗敏，薜春梅.分子生物學教學改革的探索[J].生物學雜志，2003，20（6）：51-52.

[3]朱虹.《分子生物學》教學改革的實踐與思考———啟發式教學和論證型教學的綜合運用[J].安徽農學通報，2010，16（1）：190-192.

[4]許崇波.《基因工程》課程教學改革初探[J].大連大學學報，2005，26（6）：41-43.

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[7]張金嶺.淺談多媒體教學[J].教育與職業，2009，（30）：189-190.

[8]徐啟江，李玉花.分子生物學教學改革與高素質人才培養[J].黑龍江高教研究，2007，158（6）：159-161.

第5篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

（一）領銜摸清中藥資源“家底”

2011年11月，國家中醫藥管理局啟動了第四次全國中藥資源普查，這是自1983年第三次全國中藥資源普查后，對國內各省現存中藥資源進行的一次“大摸底”。黃璐琦被命任為第四次中藥資源普查試點工作專家指導組組長。

時隔近30年，原有數據已不足以支撐產業發展的科學決策，與此同時，環境發生了巨大的變化，技術手段也有日新月異的突破。摸清國內中藥資源基本現狀，成為迫切而重要的任務。對于藏在深山里的中藥，又能有哪些新的認識？在環境的巨變下，哪些品種已經面臨瀕危？這些都擺在中醫藥人的面前。

黃璐琦介紹，普查主要完成的工作有四項：一是要探明中藥資源的種類和分布，及563個重點中藥材品種的資源總量;二是進一步調查清楚中藥資源相關知識，如民間對一些藥材的特殊用法等;三要建設一批中藥材種苗繁育基地。目前多種野生中藥材瀕危，解決資源稀缺問題，最終還得靠人工種植，通過普查遴選種植基地成為當務之急;四是建立動態監督機制，保障信息通暢。

作為專家組組長，黃璐琦除了在北京日常的繁雜工作，以及各地的學術會議、交流考察外，帶領各地資源普查隊員跋山涉水、翻山越嶺，進行技術指導、監督檢查，成了他近幾年來工作的主旋律。幾年間，細算下來，黃璐琦幾乎一半的時間都在野外跟中藥“面對面”地打交道。帶領著各地普查隊員，他走過了全國60余個的普查試點縣。“這對于我來說是一段太珍貴的經歷了！”他感嘆道。哪種中藥材是否道地、在何地分布、數量多少，他都了然于胸，談起來如數家珍。

此次922個縣級普查點遍布全國31個省、市、自治區，在野外工作的隊員達到上萬名。現在，中藥資源普查工作發現2個新屬25個新物種，匯總得到1.3萬多種藥用資源的種類和分布等信息，中藥資源種類數已超過第三次全國中藥資源普查。

黃璐琦發現，各地在中藥材種植、采收，包括資源普查工作本身，都有自己的創造：又如，田地里收割過后的麥稈，在地表留下適當的高度，正好可以用做瓜蔞的“天然”棚架，只需在麥稈所在的田里播下種子，瓜蔞在生長過程藤蔓自然攀援到這些“棚架”上，既節約時間資源，又綠色環保。

野外普查的艱難，有時不僅體現在餐風露宿的辛苦上，更直觀與危險的是面對生與死的考驗。在野外工作的隊員達到上萬名，他們的安危冷暖，時時牽動著黃璐琦的心。2012年9月7日，他剛從云南昭通彝良普查點回京，彝良就發生5.7級地震。他第一時間給當地普查辦公室打電話詢問情況，得知只有辦公房屋損壞，隊員都已平安歸隊，方才松了一口氣。“現在全國普查點分布圖深深印在我的腦海中，哪里發生自然災害我就首先想到隊員生命會不會受到威脅，時刻繃緊一根弦，深感壓力重大。”有一次，一路普查隊的車在趕赴調研蟲草途中掉下垂直高度達20米的山崖，一名隊員肋骨折斷，所幸頭部沒問題。“有一年，我帶隊分乘幾輛車到湖南湘西保靖縣普查。途徑碗米水庫時，路很窄車隊小心前行，走著走著我突然發現緊跟的第二輛車不見了，趕快叫司機停車讓大家下來沿途往回找，后來看到那輛車側翻在路基上。車上四人都是參加過第三次普查上年紀的老師，有驚無險。如果車再前移或后錯一米翻倒就會直接掉進水庫，那么普查隊員就會有生命危險。我當時站在路邊跟普查隊員說，第一，這是上天在告示我們，這項工作是要用生命來換的，我們要格外重視安全;第二，精誠所至，終成大事。”

（二）分子生藥學創建的前前后后

1992年，黃璐琦成為北京醫科大學一名博士研究生，師從著名生藥學家樓之岑和著名藥用植物學家誠靜容。“兩位導師在為學做人方面都對我產生過深刻的影響。曾擔任中國藥學會理事長的樓之岑院士，嚴謹治學的精神讓我敬仰。一位師兄給當時國內最高水平的專業雜志投稿，編輯意見是文章水平很高，但篇幅長。師兄把稿子拿給樓之岑院士，先生提筆批注‘我們不能削足適履’，后面署名‘生藥學教授樓之岑’，而后返給編輯部。最終，論文全文發表。先生的不凡氣勢和深厚功底略見一斑。”

讀書期間，黃璐琦對栝樓屬植物研究產生興趣。栝樓屬植物藥用價值和經濟價值都很高，如有抗癌作用的天花粉即來源于此屬。為調查國內栝樓屬的藥用植物，他只身一人前往廣東、廣西、云南、貴州的深山老林實地考察，采集植物。他還廣泛查閱英國、美國、澳大利亞、日本等國標本，最終整理出世界范圍的栝樓屬植物名錄，并發現新種植物，使中國在這一領域的研究達到國際先進水平，解決了被世界葫蘆科專家C. Jeffrey稱之為“東亞地區葫蘆科中最難處理的分類學難題”。黃璐琦也因此獲得北京醫科大學特等獎學金。

在進行栝樓屬植物分類學研究時，黃璐琦發現有很多問題用傳統技術和方法已經無法很好地解決，而分子水平的研究則很可能為這門古老學科帶來新的生機。

1995年，年僅27歲的黃璐琦以《展望分子生物技術在生藥學中的應用》為題將自己長期以來的思考發表在《中國中藥雜志》上，文中首次提出了“分子生藥學”的概念。這在當時沉悶許久的生藥學研究中引起了強烈的反響。隨后，一支充滿活力的創新團隊在他身邊迅速形成。科學技術的發展和學科間的交叉融合是一股強大的力量，對于中藥研究來說，借助于這股力量會給這門古老的學科帶來前所未有的生氣和活力。

以黃璐琦研究團隊為核心，在很多中醫藥學者的積極參與和大力協作下，國內第一部從基因水平研究生藥學的著作《分子生藥學》得以問世，并標志著一門嶄新的生藥學分支學科――分子生藥學在國內誕生。

從誕生的第一天起，分子生藥學就受到中藥學界的普遍關注，近年來更是捷報頻傳。2006年《分子生藥學》第二版出版，2008年適合高等院校本科生使用的《分子生藥學》教材出版。迄今，全國己有10多所高等院校開設該課程。2012年，這門新興學科成為國家中醫藥管理局中藥生藥學重點學科，也是國家中醫藥管理局重點研究室和三級實驗室所在的學科。轉瞬之間，分子生藥學于懵懂之際、晨光熹微之時發起，如今已亭亭如蓋。

2006年，38歲的黃璐琦申請了國家973項目的課題“中藥藥性理論繼承與創新研究”，而這一年是國家“973計劃”（國家重點基礎研究發展計劃）首次設立中醫藥研究專項，黃璐琦抓住這一難得的機會，開始中藥學的創新研究，并成為“973項目”年輕的首席科學家。

黃璐琦特別崇尚創新科研，在實踐研究中，他贊成要敢于提出假說。他認為，如果假說能夠經受住一種關鍵性的檢驗且能夠符合一般科學理論，那么這種假說就會被接受。在道地藥材的形成機理研究上，假說研究就得到了應用。以“973”項目為支撐，圍繞道地藥材形成的幾個模式假說，利用研究室在道地藥材分子生藥學研究和道地藥材生態學研究方面的優勢，根據經典遺傳學和表觀遺傳學的理論方法，運用生態學的原理，配合受控試驗，研究環境、遺傳因素及其交互作用影響藥材道地性的特征及表現在功效、安全性和化學成分上的變化及其規律，最終揭示了道地藥材的形成機理，在國內開創了道地藥材形成的分子機理研究的先例。2003年，黃璐琦和他的團隊還創辦了“生藥分子鑒定實驗室”，并獲得了國家中醫藥管理局三級實驗室認證。2009年，他的研究室成為“國家中醫藥管理局道地藥材生態遺傳重點研究室”。在這些獨具一格的科研平臺上，創新理論和科研實踐不再脫節。他們利用各種實驗條件驗證、完善各種科研設計，并大膽地使用這些成果去指導中藥的生產實踐。

黃璐琦引入分子生物學技術，建立起中藥材鑒別新方法，其中高特異性聚合酶鏈式反應技術鑒別中藥材烏梢蛇真偽的方法榮獲中國專利優秀獎，被2010年版《中國藥典》收載，這是分子鑒別方法首次收載于國家藥典。他帶領課題組發現了一條丹參酮合成的關鍵酶基因及二萜生物合成新途徑，并在國際著名刊物PNAS、JACS等發表了系列高水平文章。

（三）醫圣的粉絲曾經懷揣建筑夢

素有“書鄉”、“茶鄉”之稱的江西婺源，是黃璐琦的出生地。黃璐琦的母親金青是中醫師、新安醫學學派傳承人，黃璐琦從小便跟隨母親出診，并且幫助采集草藥，耳濡目染地學了一些中醫知識。

“經常有患者到我家來看病，不論什么時間段到我家，母親都會馬上放下手里的活兒、哪怕是飯碗，會專心問診。如果趕上患者來看病，沒來得及吃飯，母親就會請他們跟我們一起吃。”黃璐琦回憶說。

可以說，黃璐琦是在母親的診所里長大的，兒時玩得最多的玩具就是診室中的處方箋，偷吃最多的零食是藥房里的酵母片和山楂丸。“不知現在酵母片是不是提純了，不如印象中的好吃。”讓黃璐琦記憶清晰的是，一次周邊人家養的雞鬧疫情成群死掉后，他年幼好奇學著大人的樣子撕下一張處方紙寫下“雞瘟藥”幾個字，開出自己人生中的第一張“處方”。“那時我真以為這就可以治病了。”黃璐琦至今提起這些童趣軼事，仍舊忍不住開懷大笑。

“我是家里的老小。父親很嚴謹，骨頭也很硬，當過10多年的地方計委主任，對當地的經濟數據他都記得很準，每天堅持寫工作筆記。”黃璐琦說，父親曾希望自己學建筑，因為家里已有一個學醫的姐姐。“父親說，一個人一生能留下一個作品就足矣，而建筑是以立體的形式表現的作品。”

1985年高考，懷著一個建筑師的夢想，黃璐琦在高考志愿表上填寫了同濟大學建筑學專業。可是，命運偏偏跟他開了一個玩笑，他沒有被這個專業錄取，反而被調劑到江西中醫學院中藥專業。“這就是天意，上天安排的，我不后悔。建筑與醫藥，都是民生很大的一塊，與老百姓都息息相關。”子承母業的黃璐琦，為此投身中醫藥領域。過去對母親從事職業的驕傲自豪，逐漸變為了自己對所學專業的熱愛。

本科畢業后，他考上全國中醫藥權威機構中國中醫科學院，師從同仁堂的創始家族――樂家第十三世傳人樂崇熙攻讀碩士學位。“記得研究生復試時，樂崇熙先生耐心教我改正南方口音，區分‘您’和‘你’，還有用餐規矩、說話禮儀，這都使我頗為受益。”

“我29歲任中藥研究所所長，31歲開始擔任博導，因為年輕，所里推選我從第九屆起加入全國青聯，并且是中直機關青聯常委，后來我又成為北京市青聯副主席。于是，我和青聯組織建立了深厚的感情，青聯幫助、培養、支持了我，我也感受到這個大家庭的溫暖，愿意盡力為大家服務。當年作為醫藥衛生組的委員，我曾給自己定了一個任務，利用經常搞野外普查有些經驗的優勢，聯合同組的醫藥企業委員每年外出調研度假一次。”一段青聯路，一生青年情。黃璐琦的實驗室集結了近30位不同學科背景、不同學歷、不同年齡段的成員，這種學術互補性極強的人員組合方式在中醫藥學界并不多見。“不少青年都是可造之材，就看將他們放在什么位置，發揮怎樣作用。我的職責就是致力于發掘團隊最大的潛力，搞好中醫藥科學研究，使個人有寬松的環境、堅定的理想、明確的方向。”

黃璐琦是國家杰出青年基金獲得者，曾獲中國工程院光華工程科技獎（青年獎）、全國優秀科技工作者、中國藥學發展獎、中國青年五四獎章、中國青年科技獎、新世紀百千萬人才工程國家級人選、中國中醫藥十大杰出青年、衛生部有突出貢獻中青年專家、中央國家機關十大杰出青年、北京十大杰出青年等榮譽稱號，多次獲國家科學技術進步獎，享受“國務院政府特殊津貼”，并當選2014年中醫藥新聞人物。作為學科領軍者，黃璐琦時刻關心著團隊中青年的成長、成才、成功，特別重視培養和提升學生的人文情懷與文化素養。2015年，他當選為中國工程院院士最年輕的院士。

黃璐琦的愛好很多，體育運動最愛乒乓球，讀書則比較雜，辦公室那一面墻的書架上可以看到人物傳記、時政讀物、國學，乃至攝影類書籍，足見他生活的豐富多彩。

問及黃璐琦有偶像否，他笑言是醫圣李時珍。這么多年來，黃璐琦一直對照李時珍的事跡踐行著，在科研的路上知難而進，迎難而上。

第6篇：經典遺傳學和表觀遺傳學范文

[關鍵詞] 組蛋白去乙酰化酶；抑制劑；腫瘤

[中圖分類號] R977.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）06（a）-0015-07

Research progress of histone deacetylase inhibitors

GU Hua-wei LIU Yan SANG Jun-xia LIU Jing

Pharmacy of Department，the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology；Tumor Hospital of Anyang City in Henan Province，Anyang 455000，China

[Abstract] Histone deacetylase（HDACs） is a kind of protease which plays an important role in the modification of chromosome and regulation of gene expression，and is closely associated with the occurrence and development of tumor.Histone deacetylase inhibitors（HDACIs） of great significance in the development of the antitumor drugs.The molecular structures of HDACs，HDACs with malignant tumor，the molecular structures of HDACIs，main design ideas of HDACIs，structure-activity relationship were reviewed in this article.

[Key words] Histone deacetylase；Inhibitors；Tumor

近年來，腫瘤已經成為威脅人類健康的一大殺手。2012年全球新增癌癥病例達到1400多萬例，預計在未來20年內，癌癥死亡人數將從每年820萬飆升至1300萬[1]。2014年2月3日，世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構發表的《2014年世界癌癥報告》顯示，全球癌癥死亡率正在以驚人的速度增加，平均每8個死亡病例中就有1例死于癌癥。目前腫瘤治療方法主要是手術治療、化學療法和放射治療，花費高、治愈率低、副作用大，給患者造成了沉重的負擔，如何解決這些問題成為科研以及醫務工作者密切關注的問題。

隨著表觀遺傳學、分子生物學等研究的深入，越來越多的證據表明，腫瘤的發生發展與基因水平的病變密不可分。組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HATs）與組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）是調控基因轉錄與表達的兩個主要酶家族。HATs將乙酰輔酶A的乙酰基轉移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上，降低組蛋白與DNA的結合，激活基因轉錄及表達；HDACs使組蛋白去乙酰化，增強組蛋白與DNA的結合，染色質致密卷曲，從而抑制基因的轉錄及表達。在腫瘤細胞中，HDACs過度表達，去乙酰化作用增強，抑制了特定基因的表達，與腫瘤的發生發展具有密切聯系[2-3]。早在1990年就有科學研究[4-5]表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）有助于抑制腫瘤細胞的存活。本文就HDACs與腫瘤的關系及其現階段已經上市、處于臨床及臨床前研究的抑制劑進行綜述，以期為抗腫瘤藥物的研發提供一些新思路。

1 HDACs的結構及其與腫瘤的關系

真核細胞中，染色質由DNA、組蛋白及其他蛋白組成。組蛋白構成的八聚體緊緊環繞在DNA周圍，構成核小體，是染色質的基本組成單位。組蛋白的N-端氨基酸是可被修飾的活性位點，可以發生乙酰化、磷酸化、甲基化等作用，調控基因的表達。HDACs可能通過以下2種機制調控基因的表達：①HDACs使組蛋白去乙酰化，增強組蛋白與DNA結合，染色質致密卷曲，基因的轉錄受到抑制；②HDACs使一些非組蛋白在DNA附近集聚，與組蛋白N-端活性位點發生作用，影響轉錄過程[6-9]。

目前已知的人類HDACs存在18種亞型，根據結構和功能可以分為以下4類。Ⅰ類：HDAC1～3和8；Ⅱ類：HDAC4～7，9～10；Ⅲ類：SIRT1～7；Ⅳ類：HDAC11[10-11]。其中Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDACs為Zn2+依賴酶，Ⅲ類為NAD+依賴酶。Zn2+依賴的HDACs是研究的主要靶點，其僅有HDAC4、HDAC7和HDAC8獲得了蛋白晶體結構（圖1）。表觀遺傳學研究[12]表明，在眾多的亞型中，HDAC1和HDAC2與腫瘤發生發展的關系最為密切。

圖1 HDAC8的晶體結構及其與TSA結合（PDB ID：1T64）

組蛋白的乙酰化與去乙酰化分別受HATs和HDACs的調控，一旦平衡被打破，基因的轉錄過程將失調。病理情況下，HDACs過度表達，一些腫瘤抑制基因轉錄受到抑制，引起一系列疾病。例如，HDAC1在胃癌[13]和前列腺癌[14]中高表達，HDAC1和HDAC6在胸腺癌中高表達[15-16]，HDAC2和HDAC3在結腸直腸癌中高表達[17-18]等。因此，HDACs是抗腫瘤藥物研發中的一個重要靶點。

2 HDACIs的結構及其與腫瘤的關系

目前設計開發的HDACIs種類繁多，根據其化學結構可以分為4類：①異羥肟酸類；②苯酰胺類；③環肽類；④羧酸類。按照其結構特征又可分為3部分片段：①與Zn2+絡合的異羥肟酸結構；②中間的脂肪鏈連接部分；③親脂性的帽子結構，與受體口袋疏水性結合。臨床實驗及臨床前研究表明，HDACIs對多種腫瘤細胞具有生長抑制的作用，影響腫瘤細胞分化及誘導腫瘤細胞凋亡，用于腫瘤的單一或聯合治療（表1）。

2.1 異羥肟酸類

2.1.1 處于臨床實驗研究的抑制劑 異羥肟酸類HDACIs是在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的基礎上研究開發的。Friend等[19]在復蘇小鼠紅白血病細胞時發現DMSO對傳代細胞具有生長抑制作用，并且2/3的病變細胞有好轉的現象。該現象引起了Marks等[20]的注意，拉開了異羥肟酸類HDACIs的研究序幕。研究表明，一些極性小分子胺類化合物同樣對小鼠紅白血病細胞具有生長抑制作用，但其抑制活性未能顯著增高。兩分子的胺類化合物拼接后得到二乙酰胺類化合物六亞甲基二乙酰胺（HMBA，13）（圖2），并選擇性的改變基因的表達，從而起到抑制腫瘤細胞生長的作用，對小鼠紅白血病細胞的抑制IC50達到5 mmol/L，抑制活性得到顯著提高。臨床前研究表明，HMBA具有毒性低、良好的藥動學性質等優點。HMBA曾進入二期臨床實驗，用于治療骨髓異常綜合征和急性髓細胞白血病[21]，但由于其活性較低，劑量需求過大，在患者中耐受性差，且有血小板減少等副作用，研究被迫終止。

圖2 部分異羥肟酸類HDACIs的結構及其活性

對HMBA進行進一步的結構修飾，采用羥肟酸片段取代酰胺片段，親脂性的苯環取代一側羥基，以期同時達到離子螯合和與疏水性口袋結合的作用，獲得了一系列的HDACIs。Merk公司開發的化合物Vorinistat（SAHA，1）是該類化合物中理化性質及活性較好、毒性適中的化合物，于2006年被美國FDA批準上市，主要用于治療CTCL。Belinostat（PXD-101，2）是TopoTarget公司開發的HDACIs，對HDACs的IC50為27 nmol/L，目前已經在美國批準上市，用于治療外周T細胞淋巴瘤。Novartis公司研發的Panobinostat（LBH589，3）用于治療惡性淋巴瘤，例如CTCL已經進入Ⅲ期臨床實驗。體內外實驗表明，Italfarmaco公司開發的Givinostat（ITF2357，4）具有抗炎和細胞毒作用，一項用于治療霍奇金淋巴瘤Ⅱ期臨床實驗表明，Givinostat具有抑制淋巴瘤的作用，并且呈現出了良好的安全性。Pharmacyclics公司開發的Abexinostat（PCI-24781，5）用于治療B細胞淋巴瘤現在正處于Ⅱ期臨床實驗階段[22]。Resminostat（4SC-201，6）是可以口服的HDACIs，用于治療頑固性腫瘤處于Ⅰ期臨床實驗階段[23]。Quisinostat（JNJ-26481585，7）作為廣譜HDACIs，用于治療骨髓瘤、白血病等的研究正在進行[24-25]。

2.1.2 處于臨床前研究的抑制劑 Guan等[26]根據異羥肟酸類HDACIs的構效關系，設計一類取代1，3，4-噻二唑類的化合物，獲得了化合物14（表2），其IC50為89 nmol/L，優于SAHA，但該化合物抑制細胞增殖能力卻弱于SAHA。Guan等[27]繼續對其結構改造，用取代的芳雜環代替苯環，得到化合物15～17（表2），其對HDACIs的抑制活性與抑制細胞增殖能力均高于SAHA，有繼續開發的價值。Woo等[28]發現Trichostatin A（TSA，18）（圖2）是一種天然異羥肟酸類HDACIs，對HDAC1的IC50為5 nmol/L。Yang等[29]通過改變連接部分的C鏈長度及帽子區域的結構類型，發現了化合物19（圖2），對HDAC1的IC50為1.8 nmol/L，強于SAHA，體內外實驗具有良好的結果。Yang等[30]合成了一系列噻吩并嘧啶類異羥肟酸HDACIs，其中化合物20對HDAC1和HDAC3的IC50分別為1.14 nmol/L和3.56 nmol/L（圖2）。

表2 1，3，4-噻二唑異羥肟酸類HDACIs的結構及其活性

2.2 苯甲酰胺類

20世紀90年代，藥物化學家發現經典的抗驚厥藥地西林具有抑制細胞生長的作用，動物實驗顯示其對各種實體瘤具有一定的抑制活性。其乙酰化產物CI-994（21）（圖3）的抗腫瘤活性與地西林相當，但是代謝穩定性更強。臨床前研究表明，CI-994具有較好的抗腫瘤活性和較低的毒性[31-32]。目前，CI-994與吉西他濱聯合治療非小細胞肺癌已經完成了Ⅲ期臨床實驗。進一步結構修飾表明，CI-994的A環可被生物電子等排體，如芳香環或者芳雜環取代，但活性保持不變或增強；如脂肪鏈取代，活性降低。Hamblett等[33]用取代吡啶環代替A環合成得到了化合物22（表3），其對HDAC1的IC50為73 nmol/L。體內實驗表明，化合物22具有良好的藥動學和藥效學性質，具有開發成藥物的潛力。

CI-994（21）

圖3 CI-994的結構

表3 苯甲酰胺HDACIs的結構及其抑制活性

1999年，Suzuki等[34]報道了一類新型的苯甲酰胺類衍生物，A環的4位是亞甲氨基而非氨基取代，得到了一個活性較好的先導化合物Entinostat（MS-275，8），對HDACIs的IC50達到了4.8 μmol/L。Syndax公司正在對其進行臨床研究開發，用于治療霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等疾病，研究正在處于Ⅱ期臨床實驗研究階段，2013年9月FDA已經提議與Syndax公司聯合對Entinostat進行Ⅲ期臨床實驗研究。Paquin等[35]用吡啶、嘧啶、三嗪等芳雜環對4位亞甲氨基進行結構修飾，得到了化合物23（表3），對HDAC1的IC50為70 nmol/L。Frechette等[36]開發出了化合物24（表3），對HDAC1的IC50為60 nmol/L。Zhou等[37]用嘧啶衍生物對4位亞甲氨基進行結構修飾，得到了化合物Mocetinostat（MGCD0103，9），現在正在進行Ⅰ、Ⅱ臨床試驗，主要用于治療急性髓細胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤。未保留4位亞甲氨基結構進行的一些結構修飾，如化合物25、26及27（表3），其IC50均在nmol/L級別。

Moradei等[38]用計算機輔助藥物設計的方法，將MS-275分子與HDAC1的催化活性中心進行對接，發現B環NH2的對位方向有一個疏水性空腔，于是在MS-275的B環NH2的對位引入了噻吩基團得到化合物28（表3），活性提高了將近27倍，但是鄰間位取代活性則下降。

2.3 環肽類

環肽類化合物是HDACIs中結構最復雜、最具成藥潛力的一類化合物，對HDACs抑制活性較強，作用方式與異羥肟酸類HDACIs一致。其基本結構是疏水氨基酸構成的12元環，是親脂性的帽子結構；非天然氨基酸的側鏈構成了連接部分；與Zn2+結合區域是一些環氧酮類或者異羥肟酸片段。目前存在的環肽類HDACIs，根據結構組成可以分為含硫抑制劑、含L-Aoe的抑制劑及其他類抑制劑。

含硫的環肽類HDACIs多為前藥，分子中的二硫鍵或硫酯鍵在體內降解生成硫醇，與HDACs活性位點的Zn2+螯合而發揮作用，例如Romidepsin（FK-228，10）、FR901375（29）、Largazole（30）（圖4）。其中Romidepsin對HDAC1的IC50為0.2 nmol/L，已獲得美國FDA批準上市，主治復發或頑固性CTCL及外周T-細胞淋巴瘤。Taori等[39]從海燕藍藻中分離得到十六元環肽內酯類化合物Largazole（圖4），其對HDACs的抑制活性在nmol/L級別。其乙酰化衍生物與Largazole具有同等程度的抑制活性。Ying等[40]和Nasveschuk等[41]均已經完成了Largazole的全部合成工作。

含有L-Aoe的環肽類HDACIs大都從具有抗寄生蟲或抗增殖作用的天然產物中篩選獲得，是HDACs的不可逆抑制劑，其功能基團為（2S）-2-氨基-9、10-環氧-8-氧代癸酸（L-Aoe），所以叫做L-Aoe類抑制劑，例如化合物31～37（表4）。

還有一些其他類型的環肽類HDACIs，也具有很好的開發價值。例如Apicidin（38）[42]，對HDAC1和HDAC8的IC50分別為2 nmol/L和>1000 nmol/L，對包括胃癌、乳腺癌和子宮內膜癌在內的多種人類腫瘤細胞均有較好的抗增殖活性。

2.4 羧酸類

羧酸類的HDACIs對HDACs抑制活性較弱，為mmol/L級別，其與Zn2+結合區域是一個羧基集團。雖然表面識別區對HDACs抑制活性較為重要，但是目前研究開發的羧酸類HDACIs仍然是簡單的烷基鏈。丁酸是結腸中的微生物代謝的副產物，mmol/L級別的丁酸選擇地抑制腫瘤細胞生長的G1期，從而抑制腫瘤細胞增殖，并且不影響正常細胞結構和功能。羧酸類HDACIs作為抗腫瘤藥物，其毒性較低，但首過效應強、半衰期短，所需劑量大。其抑制活性低，可能是由于其僅僅具有HDACs抑制活性，而促進細胞分化能力較低的緣故[43]。其常與其他藥物聯合使用，如丁酸鈉和抗脂肪酸合成酶激動劑抗體聯合用藥，能起到協同誘導作用；苯基丁酸（39）（圖5）和全反維甲酸（ATRA）聯合用藥治療前髓細胞白血病[44]。因此，羧酸類化合物生物利用度低，多將羧基制成酯基，做成前藥，吸收、代謝更好。

Phenylbutyric acid（39）

圖5 苯基丁酸的結構

3 結語

HDACs是人體內一類重要的金屬蛋白酶，其參與了細胞周期調控，在腫瘤的發生發展中起到了至關重要的作用。目前已經合成了結構豐富的HDACIs，SAHA、FK228及Belinostat已成功被FDA批準上市；Largazole、Panobinostat、Entinostat等許多化合物已經進入臨床前或臨床研究階段。隨著對腫瘤發生機制及HDACIs構效關系地深入研究，HDACIs的設計開發將對腫瘤的治療產生重要意義。

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