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第1篇：自薦信標題范文

關鍵詞：充電；表面電位；等離子體；低軌道

1 概述

據統計，空間環境誘發的衛星故障，30%是等離子體對衛星表面充電導致的[1]。引起衛星表面充電的低能量電子和離子密度很大，表面充電經常發生。近年來，航天仿真技術因具有成本低廉，操作性強等優點迅速發展，本文利用歐空局SPIS軟件建立等離子體對衛星充電模型并進行仿真計算，研究其對衛星表面充電電位的影響。文中進行電位比較不考慮正負，只考慮數值大小。

2 低軌道衛星表面充電電位變化規律

2.1 低軌道空間等離子體環境

低軌道300km～500km高度等離子體密度最高，也是衛星運行的集中區域[2]，發生充電的幾率最大，我們利用SPIS軟件進行充電仿真計算，研究等離子體環境對衛星表面充電電位的影響。圖1和圖2分別是等離子體電子溫度Te和離子溫度Ti隨高度變化圖。

2.2衛星表面充電電位仿真計算

表面電位V是表征衛星表面充電特性的最重要參數，假設衛星均勻充電，我們用軟件計算衛星充電情況，得出V在Te和Ti變化時隨不同時間段變化圖3和圖4。

圖3中，在等離子體密度N=7×1011m-3，Ti=0.086eV（400km）條件下，V在T=175μs時達到最大值，此后保持不變。曲線①為Te=0.190eV時，衛星表面充電電位V=-0.285V；②為Te=0.207eV時，V=-0.327V；③為Te=0.224eV時，V=-0.371V。

圖4中，在N=7×1011m-3，Te=0.207eV（400km）條件下，V在T=175μs時達到最大值，此后保持不變。①為Ti=0.121eV時，V=-0.293V；②為Ti=0.086eV時，V=-0.321V；③為Ti=0.060eV時，V=-0.327V。

從圖3和圖4可知，V在初始階段變化明顯，此后變化趨于平緩，一定時間后達到固定值并保持不變。Te和Ti不同的情況下，V的大小是不同的。在N和Ti一定時，相同時間內，Te越高，V越高。而在N和Te一定時，相同時間內， Ti越高V越低。

2.3 衛星表面充電電位變化理論分析

V變化逐漸趨緩并最終保持不變是因為電子流密度在初始階段大，V迅速增大，其產生的負電場顯著增大，造成流向衛星表面的離子密度流逐漸增大，電子流密度逐漸減小，使V變化緩慢，最終電子流密度和離子流密度達到動態平衡，V達到最大值并保持不變。Te越高V越高，Ti越高V越低是因為隨著Ti升高，離子運動速度加快，從而充電過程中，快速移向衛星表面并中和衛星表面的電子，使衛星表面電位降低。

3 結束語

通過利用SPIS軟件進行仿真計算我們發現，等離子體中電子溫度越高，達到充電平衡時的電位數值越大；而離子溫度越高，電位數值越小。與離子溫度相比，電子溫度的改變引起充電電位的變化更加明顯，因此表面充電電位數值隨軌道高度增加而逐漸增大。隨著高度增加，電子溫度繼續升高，離子溫度變化越來越小。通常情況下，對高度1000km以上低軌道區域進行計算時，不考慮離子溫度的影響，可以使模型簡單化，提高計算速度并且對結果影響不大。低軌道通信衛星表面充電是影響其運行安全的重要因素，研究等離子體溫度對充電電位數值的影響可以為我們對衛星進行防護提高參考。

參考文獻

第2篇：自薦信標題范文

關鍵詞：DNA 計算；分子信標；NP\完全問題；Hamilton圈

中圖分類號：O157.5文獻標志碼：A文章編號：1672-1098（2016）01-0030-04

Abstract： In order to solve the classical problems in graph theory and develop a new molecular structure by using DNA， based on the principle that different forms of fluorescent molecular-quenching molecular in the molecular beacon constitutes multi color molecular beacon， the detection model for the solution of Hamilton circle， the NP\complete problem， was given. The model has the advantages of simple encoding， low complexity， easy to detect and so on.

Key words：DNA computing； molecular beacon； NP\complete problem； Hamilton circle

1994年，文獻[1]首次在實驗室用DNA分子解決了一個含有7個城市的Hmilton有向路問題，自此，誕生了一個新的研究領域――DNA計算。1996年，文獻[2]首次建立分子信標（molecularbeacon，MBs）探針，其作為一種新型的熒光探針在近年來得到廣泛的應用和發展[3-6]。

繼Adleman博士的著名實驗之后，有關Hmilton路的一些其他問題的DNA計算也取得了一些進展[7-8]。除了在電子計算機和DNA計算機上的算法研究外，部分學者還在理論上對Hmilton問題進行了一定的討論[9]。通過選擇不同的熒光分子-猝滅分子對可以設計出不同熒光的分子信標（稱多色分子信標），每個分子信標與其各自的靶標序列雜交后，會釋放不同顏色的熒光，此時，通過熒光檢測系統檢測不同的顏色來解決問題，這樣可以使多個靶核苷酸同時定量測定且加以區別，本文基于上述原理設計了一個Hmilton圈問題解的檢測模型。

關于Hmilton問題的部分數學描述如下：包含圖G的每個頂點的路稱為G的Hmilton路；包含圖G的每個頂點的圈稱為G的Hmilton圈；一個圖包含HaInilton圈，則稱這個圖是Hmilton圖。對于n階圖G，如果G含長度是n的圈，則稱G是Hamilton圖[10]。Hmilton圈問題是圖論最古老的研究課題之一，是至今未解決的世界難題，在許多領域有著重要應用，同時，它也是一個典型的NP-完全問題。

1分子信標原理

分子信標是一種設計巧妙的新型熒光探針，主要由環和莖桿部分組成。環上的寡聚核苷酸序列是分子信標的基因識別區，它能與靶基因自發地進行雜交；莖部是一段5～8mer序列互補的發夾結構。在分子信標的5’端和3’端通過連接臂連接上熒光素和猝滅劑。一般用EDANS（1一氨基萘一8一羧酸）為熒光素，用DABCYL（二甲氨基偶氮苯甲酰）為猝滅劑（見圖1）。當莖桿部分解鏈后“發夾”就會打開從而變成單鏈分子。在原始狀態下，分子信標呈莖環結構，當熒光分子與猝滅分子靠近（約為7～10 nm），即可發生熒光共振能量轉移，此時，熒光分子發出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的形式散發，檢測不到熒光信號。分子信標的工作原理如圖2所示，當有靶序列存在時，分子信標的環部即可與靶序列特異性結合，形成的雙鏈比分子信標的莖環結構更穩定，熒光分子與猝滅分子分開，熒光分子發出的熒光不能被猝滅分子吸收，這時可檢測到熒光，且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標的量成正比。本模型利用金屬納米簇作猝滅劑，通過調節金屬簇的大小、形狀和組成而得到不同種的熒光，形成多色分子信標用于同時定量標記。

2） 由步驟1得到通過圖G中的所有頂點的可能路徑集，由于使用的分子信標探針P0，P1，P2，P3，P4，P5的熒光不同，可通過熒光檢測系統檢測出帶有（且僅帶有）這六種熒光的鏈，并保留。此時，便得到了通過圖G中的每個頂點（且一次）的路徑，即hamilton路。

32.3步驟3

以圖3a為例，根據步驟1的編碼規則，若步驟2所得片段構成hamilton圈，其產物的最后必定為v0編碼的前10 bp寡聚核苷酸片段。

制作以v0前10 bp寡聚核苷酸片段互補序列為環部的分子信標探針P（見圖4b），與步驟3的生成產物進行反應，通過檢測熒光發光點的位置，判斷是否為Hamilton圈。

324步驟4

若路徑滿足上述條件，則說明存在Hamilton圈，對步驟4的結果采用非放射性標記DNA測序的方法，進行測序，讀出結果，否則，不存在Hamilton圈。

4結束語

分子信標具有結構簡單、靈敏度高及易觀測等優點，此技術在特定情況下能夠把核酸序列轉化為熒光信息。本文基于分子信標的這些特性建立了Hamilton圈問題的分子信標檢測模型。通過多色分子信標同時標記，大大減少了DNA計算的過程，具有一定的學術研究意義。此模型的復雜程度與頂點數和頂點的度有關。當然，并非由此模型生成的混合物都是問題的解，還需要通過刪選、檢測過程進行判斷。如果一個圖中不存在Hamilton圈，那么最后溶液中就不會生成可以表示Hamilton圈的分子。此外，DNA計算所應用的各種生物技術自身也存在著一定誤差，尤其是PCR技術。但隨著分子生物學技術的不斷發展，這些問題將會得到完善與解決。

參考文獻：

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[10]JA BONGDY.Graph theory with applications[M].Macmillan London Press Ltd，1976：57-65.

第3篇：自薦信標題范文

關鍵詞：戰略性新興產業類企業 融資能力 評價指標體系

一、引言

近年來，戰略性新興產業成為國家經濟發展重點扶持對象，該產業屬于技術依賴型產業，具有資源能耗低、帶動系數大、就業機會多、綜合效益好、市場前景廣等特征。不過，就目前國內該產業發展情況來看，該類產業還處于初級發展階段，從外部市場到內部管理都沒有達到一定水平，資金實力較弱，發展規模偏小，目標市場還未成熟，擁有專利技術較少，研發人才短缺且流動性較大，產業化水平較低，這些問題都嚴重制約了該類產業的發展。在眾多問題中，最根本問題在于該類產業普遍資金實力較弱，因此，解決該類產業資金問題是重中之重。

大部分戰略性新興產業中的企業屬于中小企業，因此，該類企業具有大多數國內中小企業的發展特點，所面臨的困難也有一定相似性，最大的相似點在于融資困難，各類金融機構對于新興產業類型的企業重視度不夠，貸款程序復雜，條件較高，這些都導致該類企業融資困難，嚴重限制了該類企業的發展。因此，為準確衡量和評價戰略性新興產業類企業自身的融資實力，有效規避銀行放貸風險，提高貸款資金的盈利能力，推動該類產業產業化進程，提升整體產業水平，應從該類企業本身研究衡量其融資能力的指標，并構建一套完整、科學、系統的指標體系。

二、戰略性新興產業類企業融資能力評價指標選取原則及來源

為準確、客觀、系統地評價戰略性新興產業的融資能力，保證指標選取的有效性和有用性，依據原則有：量化原則、數據可得性原則、指標代表性原則、相對量指標原則、動態與可持續性原則。

指標選取來源主要結合該類企業在發展過程中面臨的各項風險來選擇確定，這些風險包括：

第一，技術風險。由于該類產業屬于技術依賴型，而現階段國內相關技術都還在起步階段，在技術研發過程中可能會存在如技術研發周期較長、技術研發失敗、研發機構的合作關系中斷、先進技術的應用性較小、科技轉化率低等問題，這些問題都嚴重制約了該類企業的發展。

第二，市場風險。由于戰略性新興產業在我國還屬于新興產業，市場需求還沒有足夠開發，或者說市場需求不夠旺盛，盲目放貸給該類企業可能會導致供需失衡、產能過剩等后果。因此，該類企業的市場風險往往也比較大。

第三，財務風險。受市場環境影響，該類企業初期經營績效往往不會太好，這會嚴重影響到企業經營收益情況，如果企業不能持續盈利，現金流斷裂會使企業未來發展陷入僵局。

第四，宏觀政策風險。這些政策風險主要來自于國家的財稅政策、技術政策、行業扶持政策。一旦國家發揮“看得見的手”的作用，對該類產業扶持力度加大，那么就會引起該類產業水平整體提升，盈利能力增強，市場逐步擴大，而如果國家放棄扶持，那么其發展速度會受到嚴重制約。因此，國家的相關政策在該類產業發展過程中發揮著主導作用。

三、戰略性新興產業類企業融資能力評價指標體系內容

通過分析研究該類企業存在風險，結合實際發展情況，本文構建技術指標、財務指標和宏觀環境指標三個一級指標，并分設二級、三級指標來全面衡量評價該類企業的融資能力。

1.技術指標

（1）研發實力指標

①企業研發人員數量比值=研發人員總數/企業員工總數；

②企業研發人員結構比值=研發人員中各類學歷人數/企業研發人員總數；

③企業研發經費投入比重=當年研發經費總額/企業當年各項經費總額；

④企業引進人才投入比重=（研發人才引入成本+研發人才培養成本）/ 人力資源總成本；

⑤企業研發合作投入比重=企業與外單位合作研發經費投入額/企業科研經費投入總額。

（2）技術實力指標

①自有技術項目數量比值=企業自主研發專利技術數量/企業技術總數；

②引進技術項目數量比值=企業引進技術項目數量/企業技術總數；

③企業專利產出比率=企業在某技術領域的專利申請量 / 該技術領域所有專利申請量的比例；

④企業科技論文產出比率=企業當年科技數量/行業當年科技總數；

⑤企業技術市場成交率=企業在技術市場中成交合同金額/企業當年科研經費總額；

⑥企業配套技術數量比值=企業配套技術數量/企業技術總數。

2.財務指標

（1）盈利能力指標

①主營業務利潤率=利潤/主營業務收入凈額；

②資產凈利率=凈利潤/平均資產總額；

③凈資產收益率=凈利潤/平均凈資產；

④成本費用利用率=利潤總額/成本費用總額。

（2）營運能力指標

①應收賬款周轉率是指應收賬款周轉次數，即賒銷凈額/應收賬款平均余額；和應收賬款周轉天數，即日歷天數/應收賬款周轉次數；

②存貨周轉率包括存貨周轉次數，即銷貨成本/存貨平均余額；存貨周轉天數，即日歷天數/存貨周轉次數；

③流動資產周轉率，即流動資產周轉次數=流動資產周轉額/流動資產平均占用額；

④總資產周轉率，包括總資產周轉次數，即產品銷售收入/資產平均總額；總資產周轉天數，即日歷天數/總資產周轉次數。

（3）發展能力

①營業收入增長率=（當年營收額-上年營收額）/上年營收額；

②資本保值增值率=扣除客觀因素后的本年末所有者權益總額/年初所有者權益總額；

③總資產增長率=當年總資產增長額/年初資產總額；

④營業利潤增長率=當年營業利潤增長額/上年營業利潤總額；

⑤市場份額增長率=（當年市場份額-上年市場份額）/ 上年市場份額。

（4）財務抗風險能力

該類企業的財務風險主要從企業自身的償債能力來評價。

①流動比率=流動資產/流動負債；

②速動比率=速動資產/流動負債；

③資產負債率=負債總額/資產總額

④資本負債率=負債總額/所有者權益總額

⑤無形資產負債率=負債總額/無形資產

⑥稅費占營運資金比率=企業繳納稅費總額/（流動資產-流動負債）

⑦利息保障倍數=EBIT/利息費用

3.宏觀環境指標

（1）政策法律環境指標

①科技資金占財政總支出比例=當地政府財政科技撥款/當地政府財政總支出；

②政府支撐政策條款數量是指政府在相關政策條例中所規定的對該類產業的支撐條款數量；

③企業科技研發經費中政府資金占比=政府科技投入資金/企業總研發經費；

④稅收減免幅度=（某項新實施稅率-舊實施稅率）/舊實施稅率；

⑤政府為該類企業提供擔保數量是指當地政府為該類企業提供擔保的企業總數；

⑥知識產權保護條款數量是指國家法律法規條款中保護該類產業知識產權的條款數量。

（2）市場環境指標

①目標市場人均收入水平主要反映目標市場是否有足夠能力支持該類企業的產品或服務；

②目標市場恩格爾系數=目標市場食品支出總額/個人消費支出總額

③該類產業對GDP貢獻率=行業產值/GDP總量

④市場潛在需求量主要反映該類產業是否有足夠市場需求，該指標涉及到該類產業是否能長足發展；

⑤該行業銷售額增長率=（當年行業總銷售額-上年行業總銷售額）/上年行業總銷售額。

（3）技術環境指標

①行業研發經費投入比值=行業研發經費投入額/行業總投入額

②行業技術成果轉化率=已產業化的技術成果數量/行業技術成果總量

③行業技術引進消化吸收率=消化吸收的技術數量/引進技術總量

④行業技術市場成交率=技術市場成交合同金額/研發經費支出

⑤技術人才流動率=年技術人才流動量/總人才數量

⑥萬人發明專利擁有量=年末發明專利擁有量/年末總人口，指每萬人擁有經國內外知識產權行政部門授權且在有效期內的發明專利件數。是衡量一個國家或地區科研產出質量和市場應用水平的綜合指標。

四、結論與不足

通過對戰略性新興產業類企業融資能力評價指標體系的構建，為金融機構特別是銀行明確了放貸標準，為有效評價其貸款安全性和盈利性打下堅實基礎，初步保證銀行貸款安全、可靠，同時，對于該類企業，可以使其結合自身實際經營發展情況從以上這些指標著手逐步培養自身的融資能力，提高未來獲得銀行資金支持的可能性。不過，戰略性新興產業類企業雖然有共同之處，但是由于涉及行業有七項，而以上提出的指標只是針對共性提出的，對于行業特殊性方面，并未能完全體現，因此，還應在實際考察某項具體行業企業時，結合行業特點補充或者減少具體評價指標的項目。

參考文獻：

[1]王佩，李蕓. 企業融資能力與融資行為分析[J]. 經濟師，2001（9）

[2]孫威武. 企業技術創新項目風險評價[J]. 中南財經政法大學學報，2004（1）

[3]潘奇才，劉鐵兵. 高技術企業綜合水平的評價方法研究[J]. 科研管理，1996（1）

第4篇：自薦信標題范文

[關鍵詞] 新疆紫草;過表達載體;RNAi載體;GATEWAY技術

[收稿日期] 2014-06-18

[基金項目] 國家自然科學基金項目（81130070，81072989）;國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] *郭蘭萍，Tel：（010）64011944，E-mail：

[作者簡介] 謝騰，碩士，Tel：18310830559，E-mail：

新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是藥用紫草的主要來源[1]，其重要成分紫草素類化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多種藥理活性[2-4]，同時也是天然的化工染料和食品添加劑[5-6]。

紫草素類化合物通常認為是在限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、甲戊二羥酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）和對羥基苯甲酸香葉基轉移酶（PGT）催化下，通過苯丙氨酸（phenylpropan-oid，PP）-甲羥戊酸（mevalonate，MVA）復合途徑合成。PAL是PP途徑中的起始代謝酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，進而開啟對羥基苯甲酸（PHB）的合成。MVA途徑上的HMGR將甲戊二羥酸單酰輔酶A還原為甲戊二羥酸，進而生成PP和MVA途徑的中間產物焦磷酸香葉酯（GPP）。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素類化合物前體香葉基-對羥基苯甲酸（GHB）[7-8]。

次生代謝通路上關鍵酶基因表達的變化會影響次生代謝物的生物合成，可以通過改變某特定基因的表達來調節下游次生代謝，即基因的過表達（或超表達）和RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術，控制目標代謝產物的合成。為此，本研究擬構建新疆紫草次生代謝途徑中關鍵酶基因PAL，HMGR，PGT過表達和RNA干擾載體，為培育新疆紫草次生代謝物高產株系和次生代謝相關基因的功能驗證奠定基礎。

1 材料

新疆紫草愈傷細胞取自中國科學院植物研究所葉和春研究員處。

基因過表達載體pH7WG2D和RNA干擾載體pK7GWIWG2D均由中國中醫科學院中藥資源中心提供。

2 方法

2.1 目的基因序列的獲取和引物設計

在NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）下載目的基因序列：PAL（gi|90994675），HMGR（gi|91208650），PGT（gi|158957516）。

過表達載體的片段為目標基因的全長，引物位于ORF外，RNA干擾的片段引物位于ORF內。使用Primer Premier 5分別設計含CACC接頭和不加CACC接頭的合適引物。

2.2 新疆紫草cDNA的獲得

采用Trizol法新疆紫草愈傷組織細胞總RNA提取，并做RNA質量檢測。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，將新疆紫草新鮮RNA反轉錄為單鏈cDNA，并至于-20 ℃保存。

2.3 PCR擴增

2.3.1 通用PCR擴增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR擴增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.3.2 菌液PCR擴增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR擴增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.3.3 高保真PCR擴增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR擴增，以T載體克隆所得質粒為DNA模版，所用引物含CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.4 PCR產物的回收與純化

PCR擴增產物回收與純化使用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。將所得到的DNA保存于-20 ℃。

2.5 PCR產物的T載體克隆

PCR產物的T載體克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴過夜，轉入DH5α，LB平板（氨芐霉素，Amp抗性）培養過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.6 轉化大腸桿菌

選擇Trans5α感受態細胞，吸取200 μL已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素LB瓊脂培養基上，均勻涂開細胞，至液體被吸收，倒置平板，37 ℃過夜培養。篩選菌落并菌液PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.7 質粒提取

質粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit試劑盒。

2.8 GATEWAY方法構建載體

GATEWAY技術是基于λ噬菌點特異性的成熟重組體系，由BP，LR 2個反應就構成，可同時轉化多個基因，較其他載體構建方法快捷高效[9]。BP反應將目的基因從PCR產物重組到供體載體，從而形成入門載體（donor vector），LR反應則將入門克隆重組入目的載體（destination vector）[10-11]。

2.8.1 BP連接反應 使用Invitrogen公司pENTRTM SD/D-TOPO Vector做入門載體連接高保真PCR產物。在微量離心管中配制BP反應混合液（3 μL體系）：1.5 μL ddH2O，0.5 μL 高保真PCR產物，0.5 μL salt solution，0.5 μL 入門載體。22 ℃水浴3 h，轉入DH5α，LB平板（卡那霉素，Kana抗性）培養過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

2.8.2 LR連接反應 選擇BP反應測序成功的質粒，進行LR反應。使用Invitrogen公司LR Clonase Ⅱ enzyme mix介導目的基因從入門載體的連接到入門載體。過表達載體為pH7WG2D，RNA干擾載體為pK7GWIWG2D，在微量離心管中配制LR反應混合液（4 μL體系）：1 μL 入門克隆（50～150 ng），1 μL 目的載體 （150 mg?L-1），1 μL LR Clonase Ⅱ enzyme mix，1 μL ddH2O。25 ℃水浴12 h，加入1 μL proteinase K solution，37 ℃水浴5 min，終止LR反應。將LR連接產物轉入DH5α，LB平板（壯觀霉素，Spe抗性）培養過夜，篩選菌落并菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。

載體構建的流程見圖1。

圖1 載體構建流程圖

Fig.1 Flow chart of vector construction

3 結果

3.1 引物合成

依據NCBI提供的新疆紫草PAL，HMGR，PGT的cDNA序列，設計并合成目的基因過表達載體和RNA干擾載體構建所需cDNA擴增特異性引物，見表1。

3.2 T載體克隆

將已純化的過表達和RNAi基因PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接，并將產物轉入DH5α進行菌液培養，菌液PCR獲得目的基因的T載體質粒，見圖2。

表1 PAL，HMGR，PGT擴增特異性引物

Table 1 Primers of PAL， HMGR， PGT for overexpression （upper） and RNAi （lower）

引物名稱 序列（5′-3′）堿基數片段長度/bp

過表達載體PAL-FTGCTAATACTTCCACACG182 386

PAL-RGAGAACAAAAAGAAATAG18

HMGR-FTGAAACAATCATCACTTAC192 013

HMGR-RTTTATCAATGAGGTGGAC18

PGT-FTAAACATCCCAAACTAAAG191 203

PGT-RAACAAATTTTGATAATGC18

PAL-F-CACCCACCTGCTAATACTTCCACACG222 386

PAL-R-CACCCACCGAGAACAAAAAGAAATAG22

HMGR-F-CACCCACCTGAAACAATCATCACTTAC232 013

HMGR-R-CACCCACCTTTATCAATGAGGTGGAC22

PGT-F-CACCCACCTAAACATCCCAAACTAAAG231 203

PGT-R-CACCCACCAACAAATTTTGATAATGC22

RNA干擾載體PAL-FTGAGTCAATGAAGGGTAGC19490

PAL-RGAGGGGTAGGAATGGAGTAA20

HMGR-FCTCGGTTCCTATGGCTAC18525

HMGR-RCAGGAGCACATCGTCTTG18

PGT-FATTTGGATGGTGGGCAGTT19328

PGT-RTAAAGCGGGTAGGCGATA18

PAL-F-CACCCACCTGAGTCAATGAAGGGTAGC23490

PAL-R-CACCCACCGAGGGGTAGGAATGGAGTAA24

HMGR-F-CACCCACCCTCGGTTCCTATGGCTAC22525

HMGR-R-CACCCACCCAGGAGCACATCGTCTTG22

PGT-F-CACCCACCATTTGGATGGTGGGCAGTT23328

PGT-R-CACCCACCTAAAGCGGGTAGGCGATA22

1.PAL質粒DNA;2.空載質粒DNA;M.2 kb DNA Ladder（圖3～5同）。

圖2 過表達（上）和RNAi（下）基因的T載體克隆PCR凝膠電泳

Fig.2 T vectors cloned PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3 過表達和RNA干擾載體的構建

3.3.1 高保真PCR 以構建好的pGEM-T質粒為模板，使用加有CACC的特異性引物，用高保真酶Phusion High-fidelity進行PCR擴增，獲得過表達基因全長和RNA干擾基因片段，PCR產物進行純化后，進行下一步的BP反應，見圖3。

圖3 過表達（上）和RNAi（下）基因高保真PCR凝膠電泳

Fig.3 High-fidelity PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.2 BP連接反應 獲得目的片段后進行BP反應，產物轉化DH5α，在Kan抗性的LB培養皿37 ℃培養過夜，挑取單克隆，做菌液PCR鑒定，見圖4。提取測序正確樣品的質粒進行的LR反應。

圖4 過表達（上）和RNAi（下）基因BP反應凝膠電泳

Fig.4 BP reactions PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.3 LR連接反應 BP反應的產物經過LR反應，分別將目的基因克隆到過表達載體pH7WG2D和干擾載體pK7GWIWG2D上，轉化DH5α，在Spe抗性的LB培養皿37 ℃培養過夜，挑取單克隆，做菌液PCR鑒定，見圖5。測序結果顯示與目的基因的序列一致，說明新疆紫草次生代謝關鍵基因PAL，HMGR，PGT的過表達和RNAi載體構建成功。

圖5 過表達（上）和RNAi（下）基因LR反應凝膠電泳

Fig.5 LR reactions PCR gel electrophoresis of overexpression （upper） and RNAi （lower） gene

本研究從NCBI獲得新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因，使用Primer Premier 5分別設計了過表達和RNA干擾引物，和對應含CACC接頭的引物，并以新疆紫草cDNA為模版PCR克隆得到過表達載體構建所需的全長基因（長度依次為2 086，2 013，1 023 bp）和RNA干擾所需的基因片段（長度依次為490，525，328 bp）。PCR產物經過純化后連接在pGEM-T EasyVector后使用高保真酶Phusion High-fidelity做PCR，并將產物轉入了GATEWAY載體構建技術的BP反應入門載體pENTRTM SD/D-TOPO Vector，在卡那霉素抗性篩選后將新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的全長轉入過表達載體pH7WG2D，并將目的基因的編碼區片段轉入RNA干擾載體pK7GWIWG2D，經測序驗證基因無變異。

4 結論

本研究采用本實驗室研究較為成熟的pH7WG2D，pK7GWIWG2D載體，使用GATEWAY載體構建技術分別成功構建了新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因過表達和RNA干擾載體，對于新疆紫草基因功能驗證和遺傳轉化的平臺建立起到了關鍵作用。

植物的代謝無時無刻不受到基因的調控，次生代謝物發生變化，意味著指導其生物合成的代謝通路有所異動，這種異動往往是由于代謝通路上某一個或一類關鍵酶基因的表達發生了變化，所以可以人為改變某特定基因的表達來調節下游次生代謝，進而控制目標代謝產物的合成。而這種基因表達的改變，莫過于上調或下調其表達量，基因的過表達技術對應著前者，RNA干擾則與后者對應。

目的基因與一個強啟動子連接后，在載體的介導下轉入植物體，使得目的基因在整個生命過程中都有表達，即實現過表達，這對于基因功能的研究有重要意義[12-19]。例如，將新疆雪蓮查爾酮異構酶基因在煙草中的過表達，會使得煙草大量積累黃酮類化合物，總黃酮量能達到對照組的6倍[20]。基因的過表達在對次生代謝進行調控的同時會改變植物的抗性，對于新品種的選育和開發有重要意義[21-22]。例如，崔道雷等的研究表明，過表達轉錄因子對煙草中過表達云南紅梨的PybHLH基因，會顯著提高煙草的耐鹽性[23]。

RNAi形成的機制在于雙鏈RNA被降解為21～25 bp的siRNA（small interference RNA）并與特異蛋白結合為siRNA誘導干擾復合體，該復合體通過堿基互補配對識別并降解與之高度保守的同源mRNA，從而達到基因缺失的目的[24-25]，反過來就是通過研究RNAi干擾后植物所呈現的功能或表型的改變可以判斷擾基因的功能。例如，在宋婕的研究中，SmPAL1基因干擾的株系中咖啡酸的含量明顯低于對照組，丹酚酸B的含量卻有所提高，同時研究還發現RNAi植株中木質素的含量也會有所降低，由此可以認為SmPAL1基因會促進咖啡酸和木質素的合成[26]。RNA干擾除了可以調控植物次生代謝和驗證基因功能外[27-33]，同樣可以用于抗性植物的培育[34]。

由于新疆紫草分布區域狹窄，新疆紫草野生種群處于瀕危狀態，屬于國家國家重點保護野生植物[35]。生物工程培養新疆紫草獲取次生代謝產物[36]是目前滿足日益龐大的紫草素類化合物的工業和社會需求的主要手段[37]，也是新疆紫草目前研究的熱點[7-8]。過表達和RNAi載體的構建，是進一步構建過表達株系或RNA干擾株系的先決條件。搭建基于過表達和RNA干擾的遺傳研究平臺是新疆紫草次生代謝物生物合成研究的不可或缺的部分。

本研究通過GATEWAY技術成功構建了新疆紫草次生代謝關鍵基因PAL，HMGR，PGT的過表達載體和RNAi載體，同時提供了一套系統的載體構建方法，對于搭建新疆紫草功能基因挖掘和驗證的遺傳研究平臺，和PAL，HMGR，PGT過表達株系和RNAi株系的構建奠定了基礎，也填補了新疆紫草在該領域研究的空白，并為中藥次生代謝機制的研究提供了豐富的理論支持。

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Overexpression and RNAi vectors built for key secondary metabolic

pathway genes PAL， HMGR， PGT of Arnebia euchroma

XIE Teng1，2， LIU Yu-zhong2， WANG Sheng2， LIU Tan2， KANG Li-ping2， GUO Lan-ping2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China;

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Arnebia euchroma is the main source for medicinal herb Zicao. and its most important component shikonin compounds have high medicinal and industrial value. This research is aimed to build overexpression vectors and RNAi vectors for key secondary metabolism genes of A. euchroma， and bulid platform for constructions of related transgenic lines using GATEWAY technology. To build genetic material based genetic research platform is to provide a great convenience for digging and functional verification of the genes on secondary metabolic pathway， and also to fill the gaps in transgenic research of A. euchroma. This study is also important for the cultivation of shikonin high-yielding strains of A. euchroma.