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第1篇：基因工程疫苗范文

基因工程在醫學上已得到廣泛應用，并且應用領域不斷被拓寬，取得了令人驚喜的成就。

1 基因工程制藥

基因工程制藥開創了制藥工業的新紀元，解決了過去不能生產或者不能經濟生產的藥物問題。現在，人類已經可以按照需要，通過基因工程生產出大量廉價優質的新藥物和診斷試劑，諸如人生長激素、人的胰島素、尿激酶、紅細胞生成素、白細胞介素、干擾素、細胞集落刺激因子、表皮生長因子等。令人振奮的是，具有高度特異性和針對性的基因工程蛋白質多肽藥物的問世，不僅改變了制藥工業的產品結構，而且為治療各種疾病如糖尿病、腎衰竭、腫瘤、侏儒癥等提供了有效的藥物。眾所周知，醫治侏儒癥的良藥是人生長激素，倘若從人的尸體中獲取，治療一個病人就需要600具尸體的腦下垂體才能獲得足夠的量；倘若運用基因工程生產，就可從每升基因工程菌液中得到2．4g。人們為此而石破天驚的興奮!成本如此之低，又如此之高產，其巨大的經濟效益和社會效益，由此可見。

2 基因工程抗病毒疫苗

為人類抵御病毒侵襲提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血熱病毒疫苗、輪狀病毒疫苗等應用于臨床，提高了人類對各種病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的問世，使我國新生兒不再遭遇乙型肝炎病毒的侵襲，也降低了人群肝癌的發病率。又如，為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”，就是按照人類的設計，把“生物導彈”發射出去，精確地命中癌細胞，并炸死癌細胞而不傷害健康的細胞。就單克隆細胞而言，單克隆細胞在腫癌的診斷檢測、顯示定位、監測病變、監測療效等方面也有重要價值。人類還通過基因工程生產抵御各種病菌、血吸蟲、虐原蟲等疫苗，提高人體對各種傳染病的免疫力。脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世，變革了機體的免疫方式。如今，人們翹首關注困擾人類的艾滋病病毒(人類免疫缺陷病毒)疫苗的早日問世。基因工程抗體技術的發展，為克服單克隆抗體生產細胞株在生產過程中的不穩定性，為生產大量高效抗病毒疫苗提供了先進的生產工藝。

3 基因工程治療疾病

臨床實踐已經表明，基因治病已經變革了整個醫學的預防和治療領域。比如，不治之癥——白癡病，用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因，就有可能根治這種疾病。現在已知的人類遺傳疾病約有4000種，包括單基因缺陷和多基因綜合征。運用基因工程技術或者基因打靶的手段，將病毒的基因殺滅，插入校正基因，得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。人類精心設計的基因工程操作，克服了不同個體甚至物種之間由于器官移植所產生的免疫排斥作用，實現人體之間的移植已獲成功，成功的實體器官移植有腎、心、肝、胰、肺、腸，也有雙器官和多器官的聯合移植。而人體與動物之間的器官移植成為現實，臨床應用已是指日可待的事了。脫氧核糖核酸化學合成的完善和自動化，脫氧核糖核酸擴增技術的優化，為合成基因“探針”，提高臨床診斷的質量，是人類所殷切企盼的。基因治療有兩種途徑，一是體細胞的基因治療，二是生殖細胞的基因治療。體細胞的基因治療是將正常的遺傳基因導入受精的卵細胞內，讓這種遺傳物質進入受精卵的基因組內，并隨著受精卵分裂，分配到每一個子細胞中去，最終糾正未來個體的遺傳缺陷。而生殖細胞的基因治療是將人類設計的“目的基因”導入患有遺傳病病人的生殖細胞內，此法操作技術異常復雜，又涉及倫理，緩行之理充足，故尚無人涉足。

4 基因工程診病

第2篇：基因工程疫苗范文

1. 轉基因植物

轉基因作物的研究規模已達到了空前的水平。自1983年世界上第一例轉基因抗病毒植物誕生以來，轉基因作物的研制、中間試驗、田間釋放和商業化種植得到了迅速的發展，到1997年底，轉基因植物已達幾百種；轉基因作物于1986年在美國和法國首次進入大田試驗，到1997年底全世界轉基因作物的田間試驗已達25000多例；1994年，美國批準了轉基因延熟番茄的商業化生產，到1997年底，全世界共有51種轉基因植物產品被正式投入商品化生產。

轉基因作物的種植面積正在迅速擴大。全世界轉基因作物的種植面積在1995年僅為1.2×106hm2，1996年為2.84×106hm2，1997年為1.25×107hm2，1998年為2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年進一步增至4.42×107hm2，2001年已達5.26×107hm2.2001年全球轉基因作物按作物種類統計為：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按國家統計：美國占70%（面積，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中國占1%～3％，上述4國占全球轉基因作物種植面積的99%；按目標性狀分類：抗除草劑轉基因作物占77%，抗蟲轉基因作物占15%.據統計，1999年美國轉基因大豆、棉花和玉米的種植面積，分別占該國相應作物種植面積的55%、50%和30%。

轉基因作物具有巨大的經濟效益，1997年美國轉基因抗蟲棉種植面積為1×106hm2，平均增產70%，每公頃抗蟲棉可增加凈收益83美元，直接經濟效益近1億美元；1998年美國種植轉基因抗蟲玉米達5×106hm2，平均增產9%，其凈收益為68.1美元／hm2，可產生直接經濟效益3.4億美元。1995年全球轉基因作物的銷售額僅為0.75億美元，1998年達到12億美元～15億美元，2000年已達30億美元，5年間增加了40倍。預計2005年將達60億美元，2010年將達到200億美元。 

2.植物用轉基因微生物 

自上世紀80年代以來，重組農業微生物工程研究取得了突破性進展，其中新型重組固氮微生物研究已進入田間試驗，一些殺蟲、防病遺傳工程微生物進入田間試驗或商業化生產。防凍害基因工程菌株已于1987年進入田間試驗，防治果樹根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亞和美國獲準登記，目前已在澳大利亞、美國、加拿大和西歐一些國家銷售，這是世界上首例商品化生產的植病生防基因工程細菌制劑。具有殺蟲活性的轉b.t基因工程細菌，自1991年起已有多個產品進入市場。在高銨條件下仍保持良好固氮能力的耐銨工程菌株，也進入田間試驗。 

3.轉基因動物

轉基因動物主要應用于以下幾個方面：改良動物品種和生產性能；生產人藥用蛋白和營養保健蛋白；生產人用器官移植的異種供體；建立疾病和藥物篩選模型；生產新型生物材料等。1998年全球動物生物技術產品總銷售額約為6.2億美元，預計2010年總銷售額將達到110億美元，其中75億美元是轉基因動物產品。

4. 獸用基因工程生物制品

獸用基因工程生物制品是指利用重組dna技術生產的獸用免疫制劑。主要包括：單克隆抗體等診斷試劑，目前國內外正在研究、開發或已應用的單克隆抗體診斷試劑已達1000多種；基因工程疫苗，已有44例獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重組活疫苗2例。此外，還有dna疫苗和獸用基因植物源生物制品等。 

5. 轉基因水生生物 

迄今為止，全世界研究的轉基因水生生物達20余種，已有8種進入中間試驗，其中我國有一種兩例，僅有大西洋鮭1種可能已開始小規模商品化生產。

6. 我國農業轉基因生物研發現狀與產業化概況

我國轉基因植物的研究開發始于20世紀80年代，1986年啟動的863高新技術計劃起到了關鍵性的導向、帶動和輻射作用。據1996年統計，國內正在研究和開發的轉基因植物約47種，涉及各類基因103種。1997年～1999年，有26例轉基因植物獲準進行商業化生產。按轉基因性狀分：抗蟲16例，抗病毒9例，改良品質1例。按作物劃分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牽牛1例。

轉基因抗蟲棉是國內植物基因工程應用于農業生產的第一個成功范例，使我國成為繼美國之后獨立研制成抗蟲棉，并具有自主知識產權的第二個國家。1998年～2001年4年累計種植逾1.3×106hm2，減少農藥使用量70%以上，產生了巨大的社會、經濟和生態效益。由于其傘形輻射的帶動作用，抗蟲轉基因水稻、玉米、楊樹等一批后繼轉基因產品正在進行田間試驗，蓄勢待發。轉基因技術將使農業產業發生深刻的結構變化，向農業與醫藥、農業與食品、農業與加工結合的方向發展。

我國植物用轉基因微生物研究已取得長足進展，正在研發的防病殺蟲微生物13種，涉及基因16種；固氮微生物8種，涉及基因12種，大多已進入中間試驗和環境釋放試驗。我國獸用基因工程生物制品研究與產業化進展迅速，已有近70種單克隆抗體等診斷試劑投放市場，2例基因工程疫苗獲準進行商品化生產，其中重組亞單位疫苗1例，基因重組活疫苗1例。

我國轉基因水生生物研究取得了舉世矚目的成就，1985年，我國培育出世界首批轉基因魚。此后，培育出比正常生長速度快3倍～4.6倍的轉基因泥鰍。目前，轉生長激素基因鯉、轉大馬哈魚生長激素基因鯉均進入中試階段。此外，我國還開展了藻類、貝類等其他水生生物的轉基因研究。我國轉基因動物研究成績斐然，生長速度快、瘦肉率高、對某些病毒有一定抗性的轉基因豬培育成功，乳腺組織能夠表達人藥用蛋白凝血因子ix、人生長激素、人紅細胞生成素的轉基因羊已進入中試和安全性評價階段，此外，還成功地培育了轉基因牛。

第3篇：基因工程疫苗范文

【Abstract】 AIM: To design and obtain novel rotavirus (RV) VP6 gene. METHODS: On the basis of our previous reports， RV VP6 gene was optimized through the gradual splicing method， according to the improved PCR strategy. RESULTS: The optimized cDNA sequence of RV VP6 gene was successfully synthesized， which was about 1220 bp and reached 55% in (G+C) content. CONCLUSION: The optimized RV VP6 gene was obviously increased about 20% in (G+C) content compared to wildtype RV VP6 gene. This study laid a further strong foundation for the development of novel oral rotavirus genetic engineering vaccine.

【Keywords】 rotavirus; VP6 gene; genes， synthetic; genetic engineering vaccine

【摘要】 目的：設計獲得輪狀病毒（RV）新型VP6基因. 方法：本研究在前期工作的基礎上，對RV VP6基因的優化合成方法進行了探索研究. 我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優化改造. 結果：成功地合成了優化的RV VP6基因cDNA序列，該序列長約1220 bp，(G+C)含量達55%. 結論：與野生型RV VP6基因相比，優化合成的RV VP6基因(G+C) 含量提高了約20%，這一工作為新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基礎.

【關鍵詞】 輪狀病毒； VP6基因；基因，合成； 基因工程疫苗

0引言

輪狀病毒（rotavirus， RV）是引起全世界嬰幼兒嚴重腹瀉的重要病原，RV危害嚴重且無有效的治療手段［1］，根除RV感染的惟一途徑是發展安全、有效的疫苗，這已成為一個全球性的公共醫療目標，是一項十分迫切而必要的工作［2-5］. A組RV血清型眾多，VP6蛋白是其主要的組特異性抗原，有較強的抗原性和免疫原性，可誘導保護性免疫. 有研究表明，VP6蛋白的IgA mAb對RV感染具有免疫保護作用，肌注免疫VP6 DNA疫苗可產生較好的異源保護作用［6］，以VP6蛋白和黏膜佐劑免疫小鼠可誘導產生對鼠RV EDIM株的完全保護作用［7］. 根據我國RV的感染狀況，本課題組的疫苗設計方案主要包括A組RV的VP6抗原和A組RV G1，G2和G3型3種不同的VP7抗原. 前期免疫效果研究結果表明，灌胃免疫組產生的RV特異性免疫反應較滴鼻組弱，推測可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫效果弱化有關. 據此，為了發展新型高效的口服RV基因工程疫苗，我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因進行了優化合成研究，以期提高其(G+C)含量，可望增加其表達量和提高以其為目標抗原的RV疫苗的免疫效果.

1材料和方法

1.1材料PcDNAⅡ質粒，E.coli DH5α菌種和E.coli DH10B菌種均為本室保存. Agarose Gel DNA purification Kit， Pyrobest DNA polymerase，T4 DNA Ligase， 限制性DNA內切酶KpnⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XGal， IPTG， DNA Marker DL2000， dNTP mixture和Amp均為Takara產品；RNA酶為Sigma產品； 酵母提取物和胰蛋白胨為OXOID產品； PEG(4000)為Promega產品.

1.2方法

1.2.1引物合成引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.

1.2.2RV VP6基因的優化合成根據RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，重新設計了RV VP6基因的重組cDNA序列，合成了引物P11～P116和P21～P216與sP115和sP216. 根據嵌套式PCR方法制備突變體的原理［8］，我們應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列.

2結果

2.1RV VP6基因S1和S2片段的合成應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法人工合成RV VP6基因的重組cDNA序列，RV VP6基因全長S片段分為S1和S2片段兩部分先分別合成，再以S1和S2片段為模板，合成RV VP6基因全長S片段，合成策略見圖1，2. 獲得RV VP6基因S1和S2片段（圖3，4），對其進行酶切和測序鑒定（圖5，6），合成片段序列正確.

2.2獲得優化的RV VP6基因全長S片段逐步拼接法獲得了約1220 bp的RV VP6基因全長目的片段（圖7），進行酶切（圖8）和測序鑒定，目的片段序列正確.

1: RV VP6基因全長S片段；2: DNA標準DL2000.

圖7RV VP6基因全長S片段的PCR產物

1: DNA標準DL2000；2: RV VP6基因全長S片段陽性重組質粒.

圖8RV VP6基因全長S片段陽性重組質粒酶切鑒定

2.3RV VP6基因優化改造前后的序列對比分析應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法成功地優化合成了RV VP6基因. 與優化改造前的野生型序列相比，優化后的RV VP6基因(G+C)含量提高了約20％. 優化改造前后的序列對比和(G+C)含量分析見表1.表1RV VP6基因優化改造前后的序列對比分析

轉貼于 3討論

國內外新型病毒疫苗發展規劃將RV預防性疫苗列為新型病毒疫苗研制的重點項目之一，全球疫苗與免疫接種聯盟（GAVI）和WHO也十分重視中國的口服RV活疫苗，將其列為“全球疫苗腹瀉病控制和免疫規劃”主攻發展的首要疫苗. 為了發展新型高效的口服RV基因工程疫苗， 本研究在前期免疫效果研究工作的基礎上， 針對灌胃免疫組產生的RV特異性免疫反應比滴鼻組弱的問題，分析其原因可能與疫苗在胃腸道受到胃酸和消化酶的降解破壞作用，導致其表達量降低和免疫原性弱化有關，根據有關HIV和DNA序列化學合成的有關研究報道［9-17］，提高目的基因的(G+C)含量可顯著提高其表達量，從而增強其免疫效果. 據此，我們對RV VP6基因優化合成方法進行了探索研究. 根據RV VP6基因的氨基酸序列和人類細胞偏愛的密碼子，我們重新設計了RV VP6基因的cDNA序列，并增加了有助序列正確翻譯的Kozak序列，以提高VP6的表達量. 優化改造的VP6基因重組cDNA序列包含保護性堿基、酶切位點和Kozak序列，共計約1220 bp.

應用改良的嵌套式PCR策略，通過逐步拼接法對RV VP6基因的人工合成方法進行探索，我們發現應用改良的嵌套式PCR策略合成基因時，具體合成方法（逐步拼接法或兩步法）的選擇及基因合成的成功率可能主要取決于引物長度及其彼此間的重疊長度. ①當引物長度

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第4篇：基因工程疫苗范文

各位老師、各位領導：

大家下午好！

我叫榮俊，是生命科學學院的一名普通教師。今天有機會站在這里，主要是與大家進行交流，分享一下從事科研工作的體會。

今年1月10日，我在北京參加了2013年度國家科學技術獎勵大會，我參與的一個項目獲得了國家技術發明二等獎。

這個項目名稱叫《傳染性法氏囊病的防控新技術構建及其應用》，是由浙江大學、長江大學、北京市農林科學院、青島易邦生物工程有限公司共同完成的。長江大學是第二完成單位。作為主要完成人，我排名第三，動物科學學院的程太平副教授排名第六。

算起來，進行這個項目的研究，前前后后已有20多年。項目組在“863”“科技支撐”“973” 等計劃項目的持續資助下，構建了傳染性法氏囊病病毒（IBDV）反向遺傳學技術平臺，揭示了傳染性法氏囊病病毒的基因重配和復制的機制，發展了具有國際領先水平的安全的傳染性法氏囊病新型疫苗、檢測技術體系，尤其是發明的基因工程亞單位疫苗在養雞生產上的廣泛應用，為減少疫病發生、消除傳染性法氏囊病病毒變異、凈化雞場的傳染性法氏囊病作出了重大貢獻。

作為成果第三完成人，我主持了雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗的研究，組織實施了傳染性法氏囊病毒VP2 基因改造、基因表達、表達產物純化、油乳劑疫苗生產工藝研究，動物實驗研究，獲得了國家授權發明專利、農業部簽發了國家II類新獸藥注冊證書和準予生產產品批準文號、獲得國家重點新產品證書1 個。

尤其值得欣慰的是，我的發明專利技術在青島易邦生物工程有限公司得到了具體實施和應用，作為國家重點新產品，該疫苗已連續生產5年并在全國除香港和澳門所有省、市、自治區推廣使用，實現銷售收入4.776 億元，新增利稅收2.134億元。目前本成果產品的國內市場份額達到70%以上。

回顧我的科研歷程，我覺得，有幾點感受較深的體會，在此與大家分享。

第一，科研成果的獲得是大量時間和精力投入的結果。

記得黨委書記朱業宏來看我時我曾經說過一句話，我絕對不是長江大學做科研中最聰明的和最有水平的，但我肯定是最勤奮的。以這次獲獎項目的研究過程為例：傳染性法氏囊病基因工程疫苗的研究，1999年立項，2000年經費到賬后進行理論研究和前期準備。從2001年到項目通過鑒定這4年時間里，我的工作時間是每年360天。沒有節假日和星期天，每年春節后一般都是初二或初三去實驗室工作。經常是我到實驗室了，管門房的工人還沒有起來開門。

第二，不要抱怨自己所在單位的條件不好，充分利用現有試驗設備和試驗條件你一定會獲得成功。將普通設備用好也是一種創新。

我們有很多新教師和老教師習慣報怨單位沒有好的研究條件，其實好多人都沒有真正了解自己試驗室有些什么東西，能做什么。其實這是一種缺乏進取心、自我解壓的心理表現。其實在我的研究早期是沒有什么試驗設備的。當時有不少同事挖苦我要在湖北農學院研究基因工程疫苗，認為這是不可能的事。我們做基因工程疫苗抗原蛋白的表達必須做western blot，而我們實驗室沒有轉膜電泳槽，我就根據在武漢大學用過的儀器構造和原理，拆下報廢電泳槽上的鉑金絲自己制作了一個轉膜電泳槽，用我自制的設備做的實驗非常成功。用這個設備做的western blot 照片在2篇SCI論文（3.0以上）中應用。

在青島易邦公司做工藝時，要增加一步去內毒素的工藝，公司的員工要去買冷凍離心機，每臺需大約45萬元。我幫他們設計了一個可放置5個5升分液漏斗可移動操作臺，可以在冷庫和操作間移動。每個臺架加分液漏斗可相當兩臺離心機。而每個臺架的造價不到1000元。易邦的老總感嘆道，現在年輕的研究人員只知道現代化的設備，對那些管用又便宜的玻璃儀器一無所知。像這樣的例子在我的科研實踐中還有不少。

第三，國家的需求社會的需求是科研選題的最重要標準。

上世紀末和本世紀初正是我國動物疫苗生產由傳統疫苗向現代新型疫苗轉型的初期。人類醫藥中乙型肝炎病毒基因工程亞單位疫苗成功研制和應用，產生了巨大的社會效益和經濟效益。在獸醫中還沒有一個叫得響的產品，與我們前后同時進入新藥申報的基因工程疫苗有：復旦大學的豬口蹄疫病毒基因工程亞單位疫苗，西南農大的豬偽狂犬病基因缺失疫苗。這兩個疫苗因為免疫效果不佳沒有能推廣開。其中復旦大學的疫苗轉讓給內蒙古金宇集團后基本沒有生產。從特定疫苗生產的專業角度更是急需的產品。我們的產品是在產業轉型的關鍵時期推出的，是國家和社會急需的東西。2011年春天，我到荊門十里鋪去買雞做實驗，我特地問了一下養雞戶，你們免疫傳染性法氏囊病用什么疫苗，他們告訴我他們附近的養殖戶都用青島易邦的疫苗，效果非常好，免疫后基本上都可以不患法氏囊病。他們不知道我是該疫苗的發明者。聽到這樣的評價我真正有了成就感。

第四，千萬不要迷信文獻資料和專家權威。

從1990年起就有國外的論文報道用原核生物表達傳染性法氏囊病毒VP2蛋白做疫苗是行不通的。我們的研究真真切切的讓這種不可能變為了可能。在我們進行新藥申報的過程中也曾有國內的頂級專家提出質疑，其理由就是兩個：一是國外權威雜志的論文和結論；二是他們自己做過沒有成功。所以專家權威不可全信。

華中農大的陳煥春院士知道我們這個產品后，對他們試驗室的博士們發出感慨道，榮老師在長江大學做的產品賣到易邦去了（因為易邦公司在國內是排第二的獸藥企業）。所以作為長江大學人要有我們的自信。

第五，成功的最關鍵時刻是咬緊牙再堅持一會。

在該項目的研究中有兩次令人崩潰的時候。第一次是獲取目的基因，由于病理樣本中病毒數太少，加上當時缺乏經驗，實驗基本上是按書本來做。當時相同的工作反復做了10個月。反轉錄，PCR，電泳，轉化，鑒定。每星期重復2-3次，最后終于取得了正確的基因。第二次是在青島易邦做工藝時，遇上了副反應的問題。這種問題在試驗室比較不明顯，在免疫的局部出現核桃大小的結蒂組織增生。那時是三個星期一個輪回，制苗，免疫，剖檢。反復改進工藝和疫苗配比，經過11個月完成了工業生產工藝流程。

說完這些科研體會，我還想說一下感恩，做人必須常懷感恩之心。說實話，我真心感謝原農學院和現在的長江大學，為我提供了展示自己的舞臺。

感謝原湖北農學院為我提供了當時院內最高的資助，8萬元。正是湖北省科技廳的2萬元加上湖北農學院的8萬元使我能夠完成該項目。我現在是不差錢，但在當時這點錢是甘露。

感謝易邦公司的老總，杜元釗總經理，在兩次巨額賠款后仍然對該產品充滿信心。2次賠了300多萬。

感謝生科院給了我相對比較寬松的環境和條件。

感謝動科院在我離開學院后還能為我敞開試驗室。

感謝朱業宏書記親臨看望，使我這個一線的科研人員深切地體會到了組織的關懷和溫暖。

第5篇：基因工程疫苗范文

摘要：近年來，基因工程技術廣泛應用于馬鈴薯抗病、抗菌、抗蟲、抗除草劑、品質改良及生物反應器的研究中并取得了一定進展。本文綜述了近20年國內外基因工程在馬鈴薯育種上的應用現狀，為馬鈴薯產業的大力發展提供了理論依據。

關鍵詞：基因工程；馬鈴薯育種；應用現狀

中圖分類號：S532.035.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）06-0130-04

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界上廣為種植的糧、菜、飼兼用型作物，也是我國干旱和半干旱地區重要的經濟作物，可以加工制成各種產品[1]，其栽培面積僅次于小麥、水稻和玉米。全世界每年的總產量將近3×108 t，中國占了其中的18%，居世界第一位[2]。馬鈴薯以其獨特的經濟價值受到了國內外的廣泛關注，尤其近年來隨著生物能源的興起與開發，馬鈴薯也被視為一種新型的能源材料，從而掀起了對馬鈴薯生物學性狀及應用的研究熱潮[3]。

馬鈴薯為同源四倍體作物，其遺傳分離復雜、后代篩選繁瑣，用常規育種方法改良品種難度極大。盡管已培育出許多食用加工的優良品種，但至今許多優良栽培品種仍受到多種病蟲害等的嚴重危害。近些年發展起來的植物基因工程技術，可以將各種來源的基因導入馬鈴薯，使馬鈴薯基因工程取得了許多突破，顯示出誘人的前景。

1 馬鈴薯抗病基因工程

11 馬鈴薯抗病毒病基因工程

病毒病是馬鈴薯的主要病害之一，也是造成馬鈴薯退化的主要原因，嚴重危害著我國馬鈴薯的生產。隨著病毒檢測技術的發展，人們發現幾乎所有馬鈴薯品種都受到一種或幾種病毒的侵染[4]。目前已報道的侵染馬鈴薯的病毒有40余種[5]，國內發現的專門寄生于馬鈴薯的就有9種，即馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯M病毒（PVM）以及馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）[6]。其中馬鈴薯Y 病毒和馬鈴薯卷葉病毒是最主要的馬鈴薯病毒[7]。而且PVY+PVX或PVY+PLRV混合侵染帶來的損失遠遠大于各病毒單獨侵染。

馬鈴薯抗病毒基因工程主要有病毒外殼蛋白（CP）基因的交叉保護作用，RNA和反義RNA介導的抗性，核酶、缺損的復制酶基因介導的抗性以及干擾運動蛋白等[8]。在以上技術中， 利用病毒外殼蛋白基因介導植物產生抗病性是目前馬鈴薯抗病毒基因工程的熱點之一。近十多年來，應用生物工程技術將病毒外殼蛋白（CP） 基因導入馬鈴薯的研究工作已取得重要進展[9]，有些學者鑒定了表達PVX+PVY雙價CP基因轉基因馬鈴薯的抗病性，結果表明轉基因馬鈴薯對PVX+PVY復合感染產生不同程度的抗性[10]。利用反義RNA技術，有些學者用非翻譯的序列轉化植株也能產生抗性，RNA與反義RNA轉化阻礙翻譯的進行，導致基因產物減少[11]。馬鈴薯抗病毒基因工程的成果還有很多，隨著對病毒與植物相互作用機理的深入研究，抗病毒基因工程在育種上將會發揮更大的作用。

12 馬鈴薯抗真菌病基因工程

真菌性病害也是限制馬鈴薯產量和品質的主要病害之一，馬鈴薯真菌病害種類繁多，其中最主要的是晚疫病菌（Phytophthora infestans），往往造成馬鈴薯大幅度減產。近年來通過基因工程技術在馬鈴薯抗真菌病方面取得一定的進展。在馬鈴薯抗真菌病基因工程育種中大量使用的主要有植物病程相關蛋白、水解酶——幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶、抗真菌蛋白（肽）、抑制病原菌毒性因子的蛋白等等。付道林等[12]將攜帶有Ⅰ型煙草β-1，3-葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆幾丁質酶基因的pBLGC質粒導入津引8號馬鈴薯品種中，獲得了抗病轉基因品種。Ali等[13]將人工合成的4種陽離子肽基因導入馬鈴薯并對馬鈴薯病原真菌和細菌的抗菌活性進行了測試，所獲得的轉基因植株對相應病原菌的抗性都得到一定程度的增強。

13 馬鈴薯抗細菌病基因工程

近年來植物抗細菌病基因工程研究取得的進展，主要表現在阻斷病原細菌的致病途徑，強化植物抗病反應及其信號轉導途徑，植物防御基因的表達，利用非植物源抗菌蛋白和利用細胞凋亡反應控制病害的發生等方面。Dong等[14]將克隆于芽孢桿菌的N-酰基高絲氨酸內酯（AHL）水解酶基因aiiA轉入煙草和馬鈴薯，轉基因煙草和馬鈴薯對軟腐病菌（Erwinia carotovora）的抗性顯著提高。賈士榮等[15]將人工合成的Cecropin B及Shiva A基因轉入我國7個馬鈴薯主栽品種中，經溫室和田間接種試驗鑒定，部分轉基因材料對青枯病的抗性比對照提高1～3級。

2 馬鈴薯抗蟲基因工程

在馬鈴薯的整個生育期，常常遭受各種害蟲的侵襲，如蚜蟲、馬鈴薯塊莖夜蛾、蠐螬等，直接危害地上與地下部分，造成產量和品質下降，甚至導致死亡。迄今為止，各國研究人員已經利用基因工程技術分離得到了不同來源的抗蟲基因，其中用于提高植物抗蟲性的主要有兩類：一類是從細菌中分離出來的抗蟲基因，如蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因（Bt基因）；另一類是從植物中分離出來的抗蟲基因，如蛋白酶抑制劑基因（PI基因）、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。其中，Bt基因和PI基因在農業上應用最廣[16]。Arpaia等[17]的研究結果表明，雌性科羅拉多甲蟲取食了含有cry3B的轉基因馬鈴薯后，生殖能力受到了嚴重損害，不能產生后代。Marchetti等[18]從大豆中分離得到了幾種蛋白酶抑制劑基因（KTi3、C-Ⅱand PⅠ-Ⅳ），并將其導入馬鈴薯中，經檢測在表達足夠數量抑制劑的情況下，幼蟲重量的增加降低50%。

3 馬鈴薯抗除草劑基因工程

通過化學方法控制雜草已成為現代化農業生產中不可缺少的一部分，但除草劑在殺死雜草的同時不僅污染環境，有的還會對農作物的生長產生傷害。而通過基因工程技術將耐除草劑基因導入作物，增加了對除草劑的選擇性和安全性[19]。耐除草劑基因工程主要從兩個方面解決問題，一是修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感，或使其過量表達讓植物吸收除草劑以后仍能進行正常代謝；二是引入酶或酶系統，在除草劑發生作用前降解或解毒。如比利時植物遺傳部門的研究人員把編碼乙酰CoA轉移酶的Bar基因導入馬鈴薯，獲得耐除草劑的轉基因植株。

4 馬鈴薯抗逆基因工程

干旱、高溫、低溫、鹽脅迫等逆境條件影響馬鈴薯生長，嚴重時甚至導致死亡。隨著分子生物學的發展，研究者從基因組成、表達調控及信號傳導等方面進行深入研究，明確植物對逆境脅迫的耐（抗）性機理，將相關基因導入馬鈴薯以改良脅迫抗性。例如，Goddijn等[20]成功地將大腸桿菌海藻糖合成酶基因復合體otsAB基因導入馬鈴薯，明顯提高了轉基因植株的抗旱性。趙映琴[21]將AtNHX1基因轉入馬鈴薯株系中，在相同鹽濃度脅迫下，轉基因馬鈴薯的株高明顯高于對照，尤其是在高鹽條件下脅迫90 d時，大部分轉基因株系的株高均顯著高于對照。

5 馬鈴薯加工品質改善基因工程

51 馬鈴薯淀粉品質改良基因工程

在淀粉的生物合成過程中，影響淀粉品質的關鍵酶是淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase），它們共同作用影響淀粉顆粒的結構和特性。利用基因工程手段改變這些酶在植物中的表達，從而獲得具有獨特性質、新型的馬鈴薯淀粉用于食品加工或其它工業生產之中。宋波濤等[22]通過根癌農桿菌介導法將CaMV35S驅動的正/反義sAGP基因導入馬鈴薯后，轉正義sAGP基因的淀粉含量增加5%～6%，而轉反義sAGP基因淀粉含量下降達27%。在馬鈴薯中，AGPase水平降低時，直鏈淀粉含量顯著降低，而支鏈淀粉含量升高[23]。

52 馬鈴薯塊莖抗褐變基因工程

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是產生褐變現象的主要原因。許多研究者運用反義RNA技術特異抑制PPO的表達，從而達到抑制馬鈴薯褐化的目的。如Bachem等[24]將反義多酚氧化酶基因導入馬鈴薯，能夠有效增強塊莖的抗褐變能力。

53 馬鈴薯塊莖抗低溫糖化基因工程

據資料介紹，塊莖在低溫貯藏條件下的低溫糖化給馬鈴薯加工產業帶來的損失高達數千萬美元。于是，人們借助基因工程技術來解決這一難題。張金文[25]克隆了馬鈴薯栽培品種“甘農薯1號”的酸性轉化酶基因，構建了反義植物表達載體，獲得了轉基因植株。除了運用反義RNA技術外，還可通過表達自身或外源的酸性轉化酶抑制因子來改善馬鈴薯低溫糖化。如超量表達煙草酸性轉化酶抑制子的馬鈴薯在4℃低溫貯藏后塊莖中的還原糖含量與液泡酸性轉化酶的活性都顯著降低，兩者呈正相關[26]。張瓊[27]用低溫誘導塊莖特異表達融合啟動子pCL與pCLMlb的反義轉基因株系，結果酸性轉化酶的活性顯著降低，進而引起還原糖含量不同程度的下降。

6 馬鈴薯生物反應器基因工程

馬鈴薯作為生物反應器的基因工程主要有：利用馬鈴薯生產疫苗、植物抗體、蛋白質多肽藥物、糖類物質、工業可降解塑料的原料及可降解生物塑料等。Zhang等[28]利用農桿菌介導將人免疫缺陷Ⅰ型病毒 HIV-1p24蛋白插入馬鈴薯基因組，葉片中的表達量為35 mg/g。李晉濤等[29]報道，將人源輪狀病毒（RV）轉入馬鈴薯，并用小鼠口服該轉基因植株進行免疫應答研究，結果顯示，人源輪狀病毒轉基因植物疫苗聯合黏膜佐劑免疫動物可誘導特異的系統與黏膜免疫應答，且黏膜免疫強度略高于系統免疫。謝安勇等[30]利用聚合酶鏈式反應（PCR）技術，從真養產堿桿菌H16染色體DNA中擴增并克隆了調控PHB生物合成的phbB和phbC基因；雍偉東等[31]將多聚β-羥基丁酸酯（PHB）合成過程中所需的2種酶phbB和phbC的編碼基因轉入到馬鈴薯體內，并采用特定的啟動子使這些基因的編碼蛋白最后定位在細胞的葉綠體中，結果表明，轉基因馬鈴薯葉片中PHB干物質的含量可以達到0025～1800 g/kg，并且這些外源基因的表達并不影響馬鈴薯的生長和育性。

7 前景展望

馬鈴薯基因工程育種在短短十幾年中已取得了豐碩成果，其在抗蟲、抗病、抗逆等方面具有傳統育種和生產無法比擬的優越性，提高了對病蟲的抵抗和防御能力，增強了對干旱高鹽的適應性，并能減少化學農藥的使用量及保護生態環境，為培育馬鈴薯優良品系開辟了一條嶄新的道路。同時，作為生物反應器，生產人們所需要的大量疫苗和藥物，可供人類和家畜直接使用，便捷可靠。但是，目前馬鈴薯基因工程還受許多因素的制約，如轉基因效率低和轉基因生物安全性等問題。為了更好地發展和應用這項技術，在今后的研究中應著重解決以下問題：首先繼續發現新型、高效基因，并研究其機制；其次應加強研究目的基因在轉基因植株后代中的遺傳、表達穩定性；且深入研究基因抗性的機制并制定確實有效的反抗性措施。盡管還存在許多有待進一步解決的問題，但應該看到，馬鈴薯基因工程的發展速度是非常快的，其應用前景十分廣闊。參 考 文 獻：

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第6篇：基因工程疫苗范文

家長們都知道孩子進行疫苗接種非常重要，可是疫苗有哪些種類？什么是減毒活疫苗？計劃外的疫苗要不要接種？如何正確認識接種后的疫苗反應？疫苗接種有什么禁忌癥？對此，我們要科普一下。

兒童疫苗接種程序中包含減毒活疫苗、滅活疫苗和基因工程疫苗。減毒活疫苗，顧名思義是將某種病原（細菌或病毒）傳代培養，將其致病毒力減到很低的程度，只刺激免疫反應，不會使人發病；滅活疫苗就是用甲醛等將病原殺死，但是仍保留其抗原性，但絕對沒有致病力；基因工程疫苗是利用基因工程技術提取病原體的抗原成分制成疫苗，根本不是病原本身。

那么具體的疫苗有哪些種？接種程序中減毒活疫苗有：卡介苗、口服脊髓灰質炎疫苗、乙型腦炎疫苗、麻風腮疫苗、水痘疫苗、流行性腦膜炎球菌疫苗、輪狀病毒疫苗。滅活疫苗有：百白破疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗（HIB）、注射脊髓灰質炎疫苗、肺炎球菌疫苗。基因工程疫苗有乙肝疫苗和甲肝疫苗。計劃外疫苗要不要接種呢？社區疫苗接種中心能夠提供的自費疫苗有很多種，要根據兒童自身健康情況加以選擇。但是在歐美等發達國家和一些國際醫療中心，已經普遍開始建議家長為寶寶接種HIB疫苗、肺炎球菌疫苗、輪狀病毒疫苗、水痘疫苗等。

HIB疫苗是小兒肺炎、小兒腦膜炎的克星，該疫苗已被世界上20多個國家列入常規計劃免疫接種范圍。由于中國國內普遍存在抗生素濫用的現象，使得細菌對抗生素的耐藥性上升，感染后比較難診治。所以，5歲以下，尤其是兩個月到兩歲的嬰幼兒應在醫生監督下接種。

常見的接種反應有發熱，局部注射部位紅腫熱痛，皮疹，精神不振，嗜睡，食欲減退，嘔吐，腹瀉等。上述不良反應常發生在疫苗接種后頭兩天，持續1～2天后發熱及其他癥狀將相繼消失。

值得注意的是，社區接種的脊髓灰質炎疫苗，也就是我們常說的糖丸，是減毒活疫苗。有的家長在孩子服用糖丸后喂溫熱水，會影響體內抗體的產生，極個別情況下還會出現口服糖丸后感染小兒麻痹癥的病例。國際上推薦使用的是滅活的脊髓灰質炎疫苗，是注射劑型，接種后絕對不會感染小兒麻痹癥，安全性更高。

正在發熱，特別是高熱或伴有明顯的全身不適的急性癥狀時，應暫緩接種疫苗，以免接種后加劇發熱性疾病。帶兒童接種疫苗前，家長需要觀察兒童的健康狀況。

如果兒童身體不適或與平時表現異常，如突然食欲不佳、咳嗽、異常的哭鬧，家長應推遲疫苗接種時間。除了接種疫苗前須先就診，家長還須主動與護士一同檢查疫苗的包裝是否完整，核對疫苗的名稱、生產廠家、生產日期、保質期，在確保以上信息正確無誤的情況下再接種疫苗，保障孩子的安全。

器官有性別

最新的研究表明，我們的身體除了性器官，其他的器官也存在著性別的差異。我們的器官可能是“男性”或“女性”的，這可能意味著女性和男性在疾病治療的過程中需要區別對待。這個研究還可以解釋為什么有些癌癥多見于女性，而其他則多見于男性。這項研究發表在《Nature》雜志上，由英國倫敦國王學院臨床醫學中心（CSC）的科學家在果蠅中進行研究。

CSC團隊檢查了果蠅腸道干細胞。他們使用的遺傳學工具，使他們能夠打開或者關閉這些細胞中的某些基因。這允許他們改造這些干細胞變得更“雌性化”或者更“雄性化”。然后他們試圖擴增這些細胞。他們發現，“雌性化”的細胞能更好地增殖。

這種增強的能力似乎允許雌蠅在繁殖期間腸道的增長。先前的研究已經表明，后，雌蠅腸道尺寸重新調整，和改變代謝來維持再生產。在目前的研究中，研究小組發現，“雌性化”的腸道干細胞的影響是可逆的。取出雌果蠅腸道干細胞并將其“雄性化”改造，三周后發現，這些細胞出現“雄性化”的傾向，細胞會變小。

該小組還發現，雌性腸道更容易出現腫瘤。他們對此的解釋是，因為在雌性中腸道需要在繁殖期有一定的可塑性，這也導致了其更容易遭受癌細胞侵襲。據了解，脊椎動物的性腺或性器官保留相當的可塑性：成年卵巢和的細胞在小鼠體內可以轉分化為其相反性別的細胞，而只需要單一的基因變化。所以性腺細胞必須在胚胎出生后不斷強化自己的性別特征。

這是第一次證明了性腺外成年細胞被證明有著性別可塑性。在這個研究過程中，研究小組發現這種性別轉換背后潛在的重要的新機制，他們認為人體內也有著更多的器官存在著性別差異。

進一步的研究需要將果蠅中的研究成果轉化為人類的研究。如果干細胞持有這種內在的具有兩性發育的潛能，這表明了大多數器官或者組織都會有性別的“標記”，即存在性別差異，因此未來的治療可能要針對性別給出不同的解決方案。

石墨烯電極有助修復感知功能

英國劍橋大學的一項研究成果顯示，研究人員成功將石墨烯電極植入小鼠腦部，并直接與神經元連接，這項技術未來可用于修復截肢、癱瘓甚至帕金森氏癥患者的感知功能，協助他們更好地康復。

石墨烯是從石墨材料中剝離出來、由碳原子組成的二維晶體，厚度與一層原子差不多。這種材料無論是彈性、強韌度以及拉伸性能方面都遠遠優于鋼材等材料，被譽為“新材料之王”。

劍橋大學研究人員與意大利和西班牙的同行利用小鼠腦部細胞培養物進行相關實驗后發現，利用石墨烯材料制造的電極能安全地與腦部神經元連接，且連接后這些神經元可正常傳遞電波信號，不會產生不良反應。

這些與神經元直接連接的電極能把腦電波信號傳遞給外界，讓外界更清晰地了解腦部活動并修復感知功能。例如，機械臂如果能接收腦電波信號，就會按照截肢患者的想法去抓取物體；通過對這些腦電波信號的干預也會有助于帕金森氏癥患者更好地控制病情。但此前使用其他材料制作的電極效果并不理想，信號傳遞很不穩定。

據介紹，石墨烯的導電性能非常優異，測試中這一材料制作的電極實現了穩定的腦電波信號傳遞，神經元的一些特性也沒有因為與電極連接發生改變。

第7篇：基因工程疫苗范文

1葉綠體基因工程概述

1.1葉綠體簡介

葉綠體是植物進行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細胞器,能夠進行自我復制,含有雙鏈環狀DNA。葉綠體DNA分子一般長120~160kb。葉綠體DNA有IRA和IRB2個反向重復序列(分別位于A鏈和B鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個大的單拷貝區(大小約80kb)和1個小的單拷貝區(大小約20kb)。

1.2葉綠體基因組轉化優點

葉綠體基因具有分子量小、結構簡單、便于遺傳的特點,故相對于傳統的細胞核遺傳更能高效表達目的基因,這是因為葉綠體基因本身擁有巨大的拷貝數。葉綠體基因可實現外源基因的定點整合,避免位置效應和基因沉默;遺傳表達具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩定;目的基因產物對植物的影響小。利用葉綠體基因轉化的這些優點,可以加快育種速度和效率,節約育種時間。

1.3葉綠體轉化的主要過程

葉綠體轉化過程通常分4步:一是轉化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉化體系導入葉綠體;二是將外源表達框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉化的葉綠體細胞;四是繼代繁殖得到穩定的葉綠體轉化植物。

1.4葉綠體轉化的主要方法

依據葉綠體轉化的主要過程,生物學家相應地研究若干種葉綠體基因轉化的方法,其中常用的葉綠體轉化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構建完整的質粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對重組葉綠體進行連續篩選,不斷提高同質化水平,最后獲得所需的轉基因植株。二是農桿菌T-DNA介導的遺傳轉化法。將外源目的基因、選擇標記基因等構建到農桿菌的Ti質粒上,然后通過與植物組織或器官共培養,最后把所需外源基因轉化到葉綠體并獲得表達。三是PEG處理法。只需將構建好的質粒(含外源基因、標記基因、同源片斷、啟動子、終止子等)在一定的PEG濃度下與植物原生質體共培養。

2葉綠體基因工程的應用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉化為植物所需要的能量,從而轉變為人類需要的產品。植物光合效率取決于Rubisco酶的豐富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費的能量。很多科學家正試圖通過提高Rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點整合試驗取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產高光合效率作物植物的最有價值的方法。

2.2合成有機物質

由于葉綠體型轉基因植物具有環境安全性好、底物豐富、產物區域化等優點,已被越來越多的人關注,并成為工業化生產特定有機物質的可靠場所。例如,有科學家已發明了用葉綠體基因工程表達聚3-羥基丁酸酯合成相關基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質,是自然界中多種細菌的碳源及能源儲備物。具有生物可降解性,如取代化學合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構建了含phbB、phM、phbC和aadA基因表達盒的葉綠體整合及表達載體,通過基因槍轟擊法轉化煙草。Northem點雜交、RT-PCR分析結果表明,葉綠體型轉基因植株中目的基因在轉錄水平的表達明顯高于核轉化植株中相應基因。

2.3生產疫苗

人類治療用蛋白質可以在葉綠體中實現表達,表達效率取決于外源基因的整合位點,增強轉錄和翻譯的調控元件以及外源蛋白的穩定性等。人類已經在用葉綠體基因生產疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒VP3P1區和丙型肝炎病毒C區融合,并導入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達,且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白B(CTB)抗原CTB已經在葉綠體中轉化成功,預示著轉基因植物疫苗的可商業化前景。Tregoning等將TetC基因在煙草葉綠體基因組進行表達,為了增加mRNA的穩定性及在煙草葉片內表達的可行性,他們將基因進行了密碼子優化,分別表達了未經改造的富含AT(72.3%AT)和人工合成的富含GC(52.5%AT)的基因,TetC-AT和TetC-GC的表達量分別為總可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗蟲性方面,Kota和Cosa分別于1999年、2001年將BTCryZAaZ基因轉入煙草葉綠體,前者可100%殺死4000多倍抗性的抗性蟲,后者報道BT表達量達46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼SOD、APx等酶的基因已經轉入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對環境脅迫的耐受能力。

2.5葉綠體基因組在系統發育學上的應用

葉綠體在系統發育學上的優點:一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個較大的數據基礎;二是葉綠體DNA的核酸置換率適中,在應用上很有價值。然而,用葉綠體DNA研究系統發育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現象;二是雖然有越來越多的葉綠體DNA被用作分子標記來研究類群間的系統發育關系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統的形態及生理特征結合起來獲得更多的信息,才能更接近系統發育的本來面目。

2.6葉綠體基因在消除環境憂慮問題上的前景

當今最為普遍的問題就是外源基因從轉基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴散,產生超級雜草或產生和其他作物之間的基因污染,對環境極為不利。葉綠體基因工程產生的基因逃逸現象的風險遠遠低于核轉化作物,因為大多數作物中的質體DNA都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對基因污染的憂慮。

3葉綠體基因工程存在的問題

3.1葉綠體基因轉化在雜合體上的穩定性問題

由于高等植物的每個細胞中有10~100個葉綠體,每個葉綠體內有10~100個葉綠體基因組拷貝,因此轉化的葉綠體和未轉化的野生型葉綠體同時存在于轉基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩定的。在轉化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉基因植株易于同質化。

3.2植物的種類有待擴展

可能是由于大多數植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構建的同源重組片段和外源基因的插入位點。目前,已成功轉化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實的植物。

第8篇：基因工程疫苗范文

[中圖分類號]R-331 [文獻標識碼]B [文章編號]1673-7210（2008）05（c）-118-03

酶聯免疫吸咐試驗（ELISA）具有靈敏度高、特異性好的特點，廣泛應用于各種傳染性疾病的篩查，如肝炎、HIV，也可應用優生優育等。優質的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA實驗結果準確、可靠的必要條件。試驗中若不做好相關控制，易出現白板、花板、色弱和假陽性等現象。尤其是花板現象（空白、陰性、陽性對照以及室內質控孔結果正常，而標本孔的OD值卻明顯偏高）是各級臨床實驗室常遇到的問題。現將ELISA實驗操作中的影響因素總結如下：

1標本因素

以辣根過氧化物酶（HRP）為標記的ELISA測定中，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈；如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應；標本凝固不全，在臨床試驗中，有時為了爭取時間而快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；采血試管洗滌不徹底、反復使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。

因此血清標本宜在新鮮時檢測，禁用嚴重溶血的標本。一般說來，在5 d內測定的血清標本可放置于2～8℃，標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過1周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝冰存；最好使用一次性玻璃試管或真空采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷，能吸附酶標記物，不易洗脫有關；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性；血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。

2試劑因素

ELISA診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA反應試劑盒。因此，有些廠家為了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不夠，穩定性也成問題。也有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應結果。基因工程抗原較合成肽抗原有無抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區片段；第三代產品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區別如下：

基因工程抗原是抗菌素原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點。①分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗菌素原，分子量更大。②穩定性好。包被抗原的穩定性決定試劑盒的有效期，早期以合成肽為包裝抗原的試劑盒有效期只有3～4個月，改作基因工程抗原后有效期大大延長了。③基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。④純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：分子量太小；一般只含有一個抗原決定簇；純度高；穩定性差。

國內酶聯免疫試劑廠家較多；不同廠家出產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%，99.3%，78%，89%，存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩定比較差。使用劣質的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此，選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之一。

選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩定性好、批間差異小、操作方便、省時的優良檢測試劑，國家參比實驗室每年對各廠家的試劑進行質量評估并定期評估結果，可作為選擇試劑的主要依據； 要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年。最好選擇剛出廠的試劑使用；不同廠家的試劑不能混用。

不同方法學的檢測試劑會使乙肝兩對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中，常用ELISA檢測HBsAg結果為陰性，而電化學發光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外，還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的區別。單抗對變異抗原或亞型乙型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對試劑的制備應該考慮亞型及濃度的問題。

3操作技術

操作過程的控制：①嚴格按照試劑說明操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60 min。②加樣后及時放入孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底。③封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發，產生周邊現象從而導致“盎”灞的出現。④用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干；還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產生拖帶現象。⑤合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。⑥加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。⑦顯色劑盡量在臨用前配制，不使用過期顯色劑，肉眼可見淺藍的TM顯色劑不用。⑧加樣時保持顯色劑不外流；A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時要避免產生氣泡。⑨應保證酶標板清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以得到更準確、更可靠的實驗結果。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性直接影響檢測結果。由于吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

溫浴影響。在建立ELISA方法時做反應動力學研究。實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1～2 h，產物的生成可達頂峰。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。反應板孔、反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。溫育的溫度和時間應嚴格按規定控制，特別要注意邊緣位置。96孔酶標板結構特別，易產生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周邊孔與內部孔升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。

洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELISA應是靠洗滌來達到分離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固體相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎隨意。

洗滌液多為含非離子性洗滌劑中的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，又含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質恢復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度為0.005%～0.02%，高于0.02%可使包被在固相上的抗原或抗體借吸附而減低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質量的純化水，電導率小于1.5 μs/cm，洗液如果結晶應待其溶解后配制。手洗條件一致性較差，對結果影響較大。半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結果，血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞，造成未結合標記酶洗脫不徹底，導致“花板”，造成假陽性或假陰性。所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清洗幾遍。

保證洗板浸泡時間為40 s左右，孔內液體被洗板機洗得越干凈越好。

4顯色和比色

TMB經HRP作用后，約40 min顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2 h后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮納和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12～14 h）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變為橙黃色，此時可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，使用前先預熱儀器15～30 min，測讀結果更穩定。

測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492 nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

肉眼判斷結果時，顯色淺不易觀察，影響結果的準確性，必須使用酶標儀檢測，以保結果一致性。

5 HOOK效應

隨著ELISA一步法的應用，一些標本中抗原含量過高，產生HOOK效應。影響檢測結果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對半定量法可以減少HOOK反應的發生。

6干擾物質

有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果。常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫原性誘導的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應物質和其他物質等。如RF因子可與標記二抗的Fc段結合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發生變構，Fc的C1q分子結合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃ 30 min滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦）在儲存過程中可能形成二聚體，會導致本底過深，影響檢測結果。

7藥物的影響

高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現。如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播，在孕第8、9、10月常規注射200 mg乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出，而且其所生的新生兒常出現HBsAg陰性、HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式，可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體與通過胎盤進入胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物，則新生兒HBsAg檢測呈陰性，用0.5 mol的鹽酸處理標本1 h可提高檢出率。

為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內，血清中可檢出HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗的主要成分HBsAg，有方法能夠把它檢出，如電化學發光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內不應做HBsAg檢測。

8 抗原自身因素

融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響以丙肝診斷試劑盒為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，可以與血清中抗大腸桿菌的因子發生反應而產生了可疑標本。

少數HBV感染后外周血中不含HBsAg。HBV感染后絕大多數感染者外周血中可出現HBsAg，含量為5 μg/ml～600 μg/ml。據文獻報道，到目前為止在獻血員中所發現的HBsAg攜帶者最低含量為0.2 ng/ml，含量高者可達2 000 μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發性乙型肝炎、HBV的S基因發生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細胞中以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg，從而使外周血中無HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg，構成病毒外膜，根據所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時，可致a決定簇的抗原性發生改變，使機體產生的抗體對變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時出現HBsAg和抗HBs。同時乙肝疫苗接種也不能有效預防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發生在多個部位，而且幾處突變可同時存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態的持續存在。最近，有研究表明，前S1區丟失突變（氨基酸58～118）是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因，S啟動子位于前S1，是合成HBsAg的調節元件，前S1的丟失突變則會影響S啟動子的功能，進而影響HBsAg的合成。

總之，優質的試劑、狀態良好的儀器、排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。

[參考文獻]

[1]李金明. 臨床酶免測定技術[M]. 北京：人民軍醫出版社，2005.

第9篇：基因工程疫苗范文

乙肝疫苗是預防并最終控制乙型病毒性肝炎（乙肝）最有效的手段。我國以往乙肝基因工程疫苗的研究大部分單純以兒童或單純以成人研究為主，為了獲得乙肝基因工程疫苗的免疫效果和安全性，我們采用重組酵母乙肝疫苗對869例6~60歲的對象進行了免疫效果觀察，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 對象

采用多階段隨機抽樣的方法，把溫州市鹿城區人群分成城市和農村兩個層進行抽樣，在城市163個居委會中隨機抽取6個居委會，在6個居委會的12 150人中抽取982人，在128個村中隨機抽取6個村，在6個村的18 620人中隨機抽取1 167人,年齡均在6~60歲之間，共計抽取居民2 149例，經過篩選5項指標均為陰性且近期無感冒發熱，免疫前體溫正常，無接種乙肝疫苗史、肝病史及1年內無輸血史者共1120人作為免疫對象。全程接種3針疫苗者共869人，失訪人群年齡、性別與在訪人群無差異。

1.2 疫苗

采用衛生部北京天壇生物制品股份有限公司生產的重組（酵母）乙肝疫苗，劑量為每次1劑，19周歲及以上對象接種10 μg×3疫苗，19周歲以下對象接種5 μg×3疫苗，批號均為2004060204，均在效期內使用。免疫程序為0、1、6月，接種途徑為上臂三角肌肌肉注射。

1.3 血清檢測指標及判定標準

免疫前篩選時用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測乙肝表面抗原（HBsAg）、保護性抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb），試劑為鄭州安圖綠科工程有限公司生產。免疫后1個月采血，采用時間分辨免疫熒光技術(TRFIA)法進行檢測，抗-HBs診斷試劑盒（IFM法）由上海新波生物技術有限公司生產，試劑均在效期內使用。檢測由專人負責，按照說明書操作。篩選時為定性檢測，免后用定量方法檢測。

1.4 統計分析

資料采用Excel 2003進行數據二次輸入，核對后采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 抗-HBs滴度水平

2.1.1 不同性別抗體滴度比較 按照Y=lg10(抗體滴度+0.001)進行轉換，轉換后抗體滴度見表1。不同性別間差異有統計學意義，女性免疫后產生的抗體滴度高于男性。

表1 不同性別的抗體滴度比較

2.1.2 不同年齡組抗體滴度比較 隨著年齡增大，抗體滴度的幾何均數、中位數均有下降趨勢(χ2均＝0.943，n＝6，P＜0.05)(表2)。對不同年齡組抗體滴度幾何均數進行多元方差分析，不同年齡組之間一元方差分析中差異有統計學意義，二元、三元方差分析中則差異無統計學意義，年齡組與抗體滴度存在一元線性負相關，即年齡越低發生免疫應答的抗體滴度越高（P=0.000）。

表2 不同年齡組的抗體滴度比較

對性別和年齡組與抗體滴度進行交互作用分析，結果表明，性別和年齡差異均有統計學意義（F=7.402 ＞F(1,857)0.01=6.680,F=9.363＞F(5,857)=3.045) 。由而性別和年齡與抗體滴度幾何均數不存在交互作用（F=1.578＜F(5,857)0.05=2.225)。

2.2 乙肝疫苗的安全性

接種乙肝疫苗后，只有2例對象出現局部輕微的紅腫,無發熱，48 h內恢復正常，未出現嚴重的局部或全身不良反應。

3 討論

3.1 抗體滴度高低的影響因素

本研究中接種對象發生免疫應答后的抗體滴度女性的幾何均數、中位數均高于男性，這與以往報道相同[1~4]。不同年齡組間的抗體滴度幾何均數、中位數有隨著年齡的增高而減低的趨勢，且存在線性負相關，這點與時景璞等[5]報道的結果相一致，可能與年齡增高，人體對乙肝的免疫應答敏感性減低有關，因此建議易感人群盡早接種乙肝疫苗。

3.2 性別、年齡與抗體滴度關系

不同性別中均存在抗體滴度隨著年齡升高而下降的趨勢，性別和年齡與抗體滴度的關系是獨立關系，兩者不存在交互作用，這點以前的文獻報道較少。兩者單個因素與抗體滴度關系與王昕等[2]報道的抗體陽轉率類似。

3．3乙肝疫苗的安全性

接種血源型乙肝疫苗可以發生過敏反應[6]，但較少見。乙肝重組（酵母）基因工程疫苗接種后不良反應一般較輕微[2]，重組（漢遜酵母）乙肝疫苗接種引起不良反應較少見[7]，本研究未出現任何嚴重的不良反應，說明國產重組（酵母）乙肝疫苗具有良好的安全性。

（課題組成員在現場采樣和實驗室檢測中做了很多工作，特此致謝）

4 參考文獻

［1］王昕,王英文,孫樹.重組酵母乙肝疫苗接種成人后抗體幾何平均滴度的研究［J］.中國衛生統計學,2003, 20（1）:60-61．

［2］王昕,孫樹,時景璞,等.成人接種重組酵母乙肝疫苗后免疫效果的評價［J］.中國醫科大學學報,2002,31（2）：121-122.

［3］張萬華，劉流.中小學生接種乙型肝炎疫苗免疫效果觀察［J］.右江民族醫學院學報，2006，4：653-654.

［4］張鳳梅，陳希平，楊傳志,等.不同人群接種重組（酵母）乙型肝炎免疫效果分析［J］.中國計劃免疫，2004，10（3）：150.

［5］時景璞，王昕，王桂花,等.成人接種重組酵母乙型肝炎疫苗免疫效果觀察［J］.中華預防醫學雜志，2002,36（6）：366-369.

［6］梁爭論,李河民,吳小音,等.中國乙型肝炎疫苗免疫效果和免疫機理的研究進展［J］.中華實驗和臨床病毒學雜志,2002,16（1）:91-93.