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1生物學評價

1．1組織學評價

硬組織切片技術的應用始于Donath等［16］1982年報道，該技術改變了傳統組織切片需先脫鈣才能切片的方法，使附著有軟組織的骨組織不經脫鈣即可切成5～15μm薄片，以供組織學染色檢查，這種效果是常規石臘切片或樹脂切片觀察所不能代替的。硬組織切片技術可使植入物－組織界面及周圍軟組織結構保持完整。界面骨組織的量和特性，可用相應的組織形態測量工具來測定。該技術的主要特點是可以測量分析關節假體和螺釘等金屬植入物材料的骨整合。至于材料的生物相容性、材料表面結構形態的生物學效應以及材料負荷前后的具體組織學變化，均可在細胞學水平上得到滿意分析［17，18］。相比而言，常規組織學切片需要標本脫鈣和脫金屬，因此無法得到上述數據。應用硬組織切片技術也能研究到硬組織工程材料被多核巨噬細胞吞噬的積極吸收過程，界面組織的巨噬細胞胞質內有時可觀察到植入材料顆粒。隨著技術改良，硬組織切片逐漸克服了界面裂隙和材料脫片等問題［19］，已經成為評價植入物材料骨整合的金標準。常規染色，包括蘇木精－伊紅（HE）染色、甲苯胺藍染色及Masson染色等。HE染色主要用于觀察植入材料周圍淋巴細胞、巨噬細胞浸潤情況，材料與周圍軟組織的關系及材料對骨膜成骨的影響；甲苯胺藍染色后成骨細胞、破骨細胞、骨細胞呈藍色；Masson染色后骨小梁呈藍色，成骨細胞、破骨細胞呈粉紅色，類骨質為大紅色［20］。這些成熟的染色技術，是目前骨整合組織學評價中常用的組織顯色方法。免疫組織化學染色，是目前骨整合分子機制研究中的一個重要方法。它應用免疫學基本原理———抗原抗體反應（即抗原與抗體特異性結合），通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色，以確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質等）并對其進行定位、定性及定量研究，故稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。目前研究已知，骨整合過程中存在一些重要的小分子“信使”，通過特定的信號轉導途徑介導骨整合形成；一些骨組織中的局部生長因子，如轉化生長因子（TGF）－β、骨形態發生蛋白（BMP）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，通常以自分泌和（或）旁分泌形式調節細胞增殖分化，促進界面骨組織修復愈合。免疫組織化學染色方法可以將這些小分子顯現出來，進而對其分布、密度等參數進行分析［21］。親骨熒光素染色法，在界面新骨形態計量研究中占據重要地位。四環素與新生骨組織中的鈣螯合后，在紫外線激發下可發出強烈的黃綠色熒光，因此在熒光顯微鏡下很容易觀察界面新生骨質。熒光雙標記技術則可評估骨形成速度，通常分2個時間點給實驗動物注射四環素（或者第一次使用四環素標記，第二個時間點采用鈣黃綠素標記，以達到不同熒光顯色的效果），處死動物后制作硬組織切片，并通過測定2條熒光帶之間的寬度等參數來計算骨質沉積速度（骨礦沉積率＝2條熒光標記線之間距離／標記間隔時間）［22］。此外，茜素紅染色也適用于對材料生物活性的體外研究，其原理是利用茜素紅與鈣發生反應可產生深紅色的化合物，使在材料表面接觸培養的成熟成骨細胞分泌沉積的鈣結節被明顯染色，并通過計算鈣結節大小和密度等參數來判定材料促進成骨的能力。

1．2細胞與分子生物學評價

材料植入體內時存在成骨細胞與其他細胞（如成纖維細胞等）的表面競爭貼附，因此在評估種植材料的生物活性時觀察材料是否能夠促進成骨細胞在其表面早期大量附著，并形成良好的細胞形態和功能，是一個重要指標［23］。在眾多材料－骨界面體外實驗模型研究中，都將成骨細胞在種植材料表面的增殖能力和功能表達，視作評價材料生物活性的一項重要參數［24］。掃描電鏡可以清晰直觀地觀察研究體外培養的成骨細胞在材料試樣表面的接觸、黏附、伸展、分裂增殖、分泌細胞外基質和凋亡過程。但是，掃描電鏡僅能對體外標本進行觀察，無法對植入物的體內骨整合進行評價，而目前體外實驗還難以模擬出復雜的體內微環境，因此目前掃描電鏡觀察僅可作為一種材料骨整合的輔助評價手段［25］。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和新型四甲基偶氮唑鹽（MTS）比色法的原理相似，即活細胞中的線粒體脫氫酶可將3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽還原而產生紫色結晶物，其結晶量與活細胞數量成正比。MTT溶解液萃取紫色結晶物后用酶標儀測定490nm處的光密度（OD）值，可反映活細胞數目。MTT法不足之處是產生的還原產物不溶于水，添加溶解液萃取的同時也使活細胞裂解死亡，不利于對材料－細胞相互作用的動態研究。經改良，MTS法的還原產物可溶于細胞培養液，提取簡便，不損害實驗細胞［26］。骨鈣素是由分化成熟的成骨細胞分泌的一種非膠原骨基質蛋白，是骨形成的決定因素，能夠調節礦物質形成速率和方向。堿性磷酸酶（ALP）是參與骨組織再生、代謝的一種重要物質。利用試劑盒測定在材料表面接觸培養的成骨細胞外骨鈣素水平，以及在細胞內的ALP活性變化，可以了解成骨細胞分化成熟程度和細胞成骨礦化能力，從而反映材料的生物活性。ALP高表達可以啟動細胞外基質礦化和鈣磷沉積過程，它的作用可能是通過促進機體局部形成高濃度PO43－，從而為骨組織內羥基磷灰石（HA）的成核、結晶提供條件。逆轉錄－聚合酶鏈式反應（RT－PCR）技術，是將RNA的反轉錄和互補DNA（cDNA）的聚合酶鏈式反應（PCR）相結合的技術，可用于檢測細胞中基因表達水平。骨組織中成骨細胞的分化和增殖受到多種細胞因子的調節，因此對骨組織細胞因子的研究顯得尤為重要，RT－PCR技術可以對BMP、纖維粘連蛋白、血管內皮生長因子、骨保護素等多種骨組織細胞因子的mRNA進行定量分析［27］。Kodama等［28］報道對鈦基進行表面改性，并利用RT－PCR技術檢測其表面成骨細胞中骨粘連蛋白和骨鈣素mRNA水平，以評價其表面的骨形成能力。

2醫學影像學評價

醫學影像學技術在過去10多年發展迅猛。雙能X線吸收法（DXA）、外周骨定量CT（pQCT）和顯微CT（micro－CT）等已廣泛運用于臨床和基礎骨形態計量學研究，可提供骨（面、體）密度和微觀結構的重要數據。納米CT（nano－CT）已在實驗室得到應用，主要用于骨陷窩數量、大小和形態的定量研究。MRI技術有了很大發展，不僅可描述關節軟骨形態，還可定量軟骨體積和生化成分的變化，其擴散張量成像（DTI）技術更可定量評價膠原纖維網絡的連接性和方向排列；MRI分辨率也不斷提高，目前臨床使用的3TMRI和試驗使用的7T顯微MRI（micro－MRI）均已達到微米級別［29］。因此，醫學影像學技術已成為骨關節疾病臨床早期診斷和預后判斷的希望所在。隨著計算機軟硬件水平的提高和有限元技術在生物力學中不斷深入應用，近年關于骨與關節生物力學研究已從傳統的對骨性結構的簡單線性模擬，逐漸提高到對骨與關節及其附屬韌帶與肌肉組織的非線性仿真計算上。利用影像學技術（主要為CT和MRI）數據采集模式獲取原始數據，通過高仿真度非線性三維有限元分析與先進的生物力學離體標本測試手段探討骨與關節非線性力學特征，可為骨與關節穩定性評估、骨與關節功能重建、骨科植入物研制、關節假體設計、脊柱畸形矯正等臨床重點難點問題提供理論指導。

2．1X線檢查

通過廉價簡便的X線攝片可隨時觀察植入物位置，并對植入物在體內情況進行評分，通常參考Lane－SandhuX線片評分標準［30］。Tiedeman等［31］研究認為，這一評分標準與評價骨缺損愈合情況之骨密度、骨剛度、骨干重及抗扭曲強度等常用客觀指標有高度相關性，因此仍在一些實驗研究中應用。但是，普通X線檢查對骨組織與生物材料界面的評估既缺乏敏感性也缺乏特異性，故目前僅用于對植入物置入位置及植入情況作簡單篩查。有研究將X線與組織切片技術相結合，得到高分辨率圖像，并應用此技術對生物材料與骨組織界面上的相互作用進行評價。

2．2micro－CT

常規CT檢查由于分辨率偏低、金屬偽影較大等限制因素，一直無法廣泛應用于生物材料與骨組織界面的分析研究，但是隨著micro－CT的產生，CT分辨率得到極大提高，掃描協議的改進也顯著減少了偽影干擾。近年來，有相關研究探討了含有金屬植入物骨組織標本的界面分析，如在關節假體松動模型中對金屬植入物－骨界面的評價，micro－CT掃描較傳統的硬組織切片方法具有更高的分辨率（最小可達2μm），同時通過三維重建可精確測量骨標本內部骨小梁三維結構參數與密度參數［32，33］，并可獲得三維立體的植入物－骨界面信息，對骨整合的評價更加客觀和全面。然而由于目前仍存在技術上的缺陷及缺乏有效的評價方法，micro－CT對骨整合的評價受到限制。一方面金屬物均會產生較強偽影，可干擾金屬與骨組織界面接觸的觀察和定量分析［34］；另一方面，由于軟件分析方面的限制，對骨整合界面的分析仍然停留在對金屬物內骨長入量、骨小梁結構、骨密度等方面的簡單評價，而這些指標并不能客觀、有效地評價植入物與骨組織之間的相互作用及結合強度，對骨整合及假體松動等的評價仍然缺乏說服力。但不可否認，隨著掃描協議的改進及圖像分析技術的提高，micro－CT對骨整合的評價仍然是今后的一個熱點。

2．3micro－MRI

近年來，MRI對于骨組織的顯像開始受到關注并取得了一些進展，定量MRI顯像為骨小梁的結構和功能研究提供了新的手段。它可以為一些疾病的進展和轉歸提供不同于CT的結構信息。此外，MRI技術為骨丟失機制研究提供了完全無創的途徑，在一定程度上可補充甚至取代骨活檢功能。然而，目前在圖像的獲取與處理方面仍然有許多技術問題。受目前技術限制，MRI分辨率仍然不能夠滿意地評價骨小梁結構，而且這種對于骨小梁結構的有限分析仍主要局限于四肢骨骼，而臨床最為常見的骨折多發生于股骨近端和椎體。通過場強提高、脈沖技術改進以及參數矯正技術，一些不足正在得以改進。與CT和X線相比，micro－MRI不僅能夠區別出骨與非金屬類植入材料，而且可以將不同類型的軟組織區分開來。目前的研究顯示，micro－MRI圖像上的信號強度與組織學切片上組織結構有明確關聯。有研究［29］認為，micro－MRI可用于分析脊椎融合過程中非金屬類植入物材料的骨整合過程，同時也可用于監控可生物降解的網籠材料的降解過程；micro－MRI在評價與分析生物可降解性材料和非金屬類材料骨整合中將起到重要作用。隨著MRI分辨率不斷進步，臨床上運用MRI對這些材料的骨整合進行評價和分析將為之不遠。總之，micro－MRI有望成為評價早期骨整合的重要方法之一，在科研和臨床上發揮更大作用。

2．4核醫學顯像

臨床上，核醫學顯像在鑒別硬組織工程材料在人體內骨組織界面發生的是無菌性抑或感染性松動方面，具有獨特優勢。單純X線平片在兩者鑒別上既不靈敏也不特異，而CT斷層顯像及MRI因受到偽影的干擾而作用也十分有限，核醫學顯像反映的主要是病變的生理變化而不是解剖結構，因而不受假體偽影的干擾，是目前比較公認的首選方法。單純99锝－亞甲基二膦酸鹽（99Tc－MDP）靜態顯像具有良好的陰性預測值，且可明確指出松動的具體部位，對術前評價病情有重要意義，可作為一項初步檢查。以往比較經典的99Tc－MDP靜態顯像判斷假體無菌性松動或感染性松動的標準是將沿著假體周圍呈彌漫性分布的異常放射性濃聚判斷為伴發感染，而認為假體遠端或兩端骨組織放射性增高多為單純假體松動所致。可是有研究報道，99Tc－MDP靜態顯像對鑒別假體無菌性與感染性松動的準確率并不高。因此，有學者試用骨三相顯像來鑒別假體無菌性和感染性假體松動［35，36］，并顯示較高的特異度和敏感度。近年通過與CT技術相結合，核醫學顯像技術得到新發展。單光子發射CT（SPECT）與正電子發射斷層顯像（PET）同樣是功能性評價技術，它們與CT相結合后即產生SPECT／CT和PET／CT技術，相比一般核醫學成像，多了CT利于定位的優勢［37，38］。近年這種技術開始應用于對金屬植入物骨整合的評價［36］，其中對植入物相關性骨髓炎的診斷就很有價值［39］，其原理是基于對注射到患者體內的一種放射性物質產生的正電子進行檢測，而PET和CT聯合成像將使感染的診斷更加準確、及時。但是PET／CT對金屬植入物界面的評價也存在明顯缺陷，即PET／CT圖像中金屬偽影仍然比較明顯［40］。目前可通過多種方法減輕金屬植入物對PET／CT成像的影響，其最為徹底的辦法還有賴于CT重建算法的發展。針對消除金屬偽影的各種CT重建算法的效果已得到一定證實，但部分成果還未完全應用于臨床，還需要經過更多模擬和臨床試驗對這些方法的可靠性進行評估。

3生物力學分析

3．1傳統分析方法

近年有學者提出假體生物力學相容性的概念，認為良好的應力分布是人工關節取得理想效果的前提條件。常用研究植入物生物力學性能的指標，包括頂出實驗、牽拉實驗、扭轉實驗等［41，42］。植入物的拆卸扭力常作為反映骨整合的生物力學尺度，因而植入物拆卸扭力增大，能反映種植體骨整合強度的增加［43］。對于植入物－骨界面形成骨整合后的力學分析實驗或模型的研究很多［41－44］，總體上傳統生物力學分析方法仍是目前評價植入物骨整合中生物力學參數的金標準，然而由于其為有創性等缺點，目前主要應用于體外研究，并且難以對骨整合的生物力學參數進行動態分析。

3．2有限元分析方法

由于標本來源受限、實驗條件控制困難等原因，實驗生物力學的研究受到一定限制。計算機有限元分析法應運而生。有限元這一概念最早出現于20世紀40年代，有限元分析法是一種用于結構分析的矩陣方法，其在機械工程學的成功應用促進了其在生物學領域的應用研究。有限元分析法應用于骨生物力學研究已有30余年，并在人工關節、假肢等領域取得廣泛成功［45－47］。在人工關節領域［46］，有限元分析法主要應用于對關節假體松動的力學分析，其中包括應力分析、摩擦界面磨損分析、固定界面微動分析、關節活動度及穩定性分析、骨整合和改建過程模擬等方面。假肢殘端與接受腔形成的人機界面［47］，是生物力學分析的另一個重要方面，也是有限元分析的另一個重要應用領域，但是與其他力學問題不同的是，建立人機界面有限元模型，需要人體組織力學性能，而且更深入的問題是外力作用對人體組織的影響。Belytschko等［48］于1974年首次將有限元分析法用于脊柱生物力學研究，近幾十年來有限元分析法在脊柱生物力學研究中的應用日益廣泛與深入［49－51］。由于植入物骨整合的復雜性，以往的實驗方法如電測法、光彈法等，難以獲得全域性信息。有限元分析法具有無創性、全息性的獨特優勢，盡管目前仍然存在數學模型建立困難、難以建立合理的復雜問題簡化模型等問題，但今后仍可能成為生物力學分析的主要方法，具有廣闊前景。

4結語

近年骨科臨床和醫療器械制造業對于硬組織工程材料骨整合評價的需求均急劇增加，傳統生物學分析方法、新興醫學影像學及生物力學分析法由此得到重要改良和發展。一方面，傳統分析方法對生物材料骨整合的評價更趨于完善，并規避了一些常見問題，對骨整合的評價也越來越全面、深入，在分子和基因水平評價分析骨整合、探究機制方面取得了很多新成果；另一方面，新興醫學影像學及生物力學則為界面骨整合的分析提供了一種活體、無創、立體直觀、動態的分析方法，在很多方面彌補了傳統分析方法的不足，成為傳統分析方法對骨整合評價的重要補充。可以預見，上述評價方法將繼續發展和改進，尤其是免疫組化技術、轉基因技術、micro－MRI／micro－CT以及有限元分析法等，有望為硬組織工程材料骨整合機制研究與應用評價作出更大貢獻，最終助力于研發出性能更加優異的醫用材料。