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第1篇：表觀遺傳學主要研究范文

基因表達正確與否，既受控于DNA序列，又受制于表觀遺傳學信息。表觀遺傳學主要通過DNA的甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA調控等方式控制基因表達。近年發現，副突變也包含有表觀遺傳性質的變化。

1.DNA甲基化

DNA甲基化是由酶介導的一種化學修飾，即將甲基選擇性地添加到蛋白質、DNA或RNA上，雖未改變核苷酸順序及組成，但基因表達卻受影響。其修飾有多種方式，即被修飾位點的堿基可以是腺嘌呤N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位和胞嘧啶的C-5位，分別由不同的DNA甲基化酶催化。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾堿基，CG二核苷酸是最主要的甲基化位點。DNA甲基化時，胞嘧啶從DNA雙螺旋突出，進入能與酶結合的裂隙中，在胞嘧啶甲基轉移酶催化下，有活性的甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至胞嘧啶5-位上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化不僅可影響細胞基因的表達，而且這種影響還可隨細胞分裂而遺傳并持續下去。因此，它是一類高于基因水平的基因調控機制，是將基因型與表型聯系起來的一條紐帶。在哺乳動物細胞的基因組DNA中，約有3%～5%的胞嘧啶是以5-甲基胞嘧啶形式存在的，同時70%的5-甲基胞嘧啶參與了CpG序列的形成，而非甲基化的CpG序列則與管家基因以及組織特異性表達基因有關。因而CpG的甲基化與否在基因的表達中起重要作用。高度甲基化的基因，如女性兩條X染色體中的一條處于失活狀態，而為細胞存活所需一直處于活性轉錄狀態的持家基因則始終處于低水平的甲基化。在生物發育的某一階段或細胞分化的某種狀態下，原先處于甲基化狀態的基因，也可以被誘導去除甲基化，而出現轉錄活性。

2.組蛋白修飾

組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，是一類小分子堿性蛋白質。組蛋白有兩個活性末端：羧基端和氨基端。羧基端與組蛋白分子間的相互作用和DNA纏繞有關，而氨基端則與其他調節蛋白和DNA作用有關，且富含賴氨酸，具有極度精細的變化區，這類變化由乙?；?、磷酸化、甲基化等共價修飾引起。這些修飾可作為一種標記或語言，是“組蛋白密碼”的基本組成元素。這種組蛋白密碼可被一系列特定的蛋白質所識別，并將其轉譯成一種特定的染色質狀態以實現對特定基因的調節，這顯著地擴大了遺傳密碼的信息儲存量。

3.染色質重塑

真核生物染色質是一切遺傳學過程的物質基礎，染色質構型局部和整體的動態改變，是基因功能調控的關鍵因素。染色體重塑是指染色質位置和結構的變化，主要涉及在能量驅動下核小體的置換或重新排列，它改變了核小體在基因啟動子區的排列，增加了基因轉錄裝置和啟動子的可接近性。染色質重塑的發生和組蛋白N端尾巴修飾密切相關，尤其是對組蛋白H3和H4的修飾。修飾直接影響核小體的結構，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結合位點。染色質重塑主要包括兩種類型：一類是含有組蛋白乙酰轉移酶和脫乙酰酶的化學修飾;另一類是依賴ATP的物理修飾，利用ATP水解釋放的能量解開組蛋白和DNA的結合，使轉錄得以進行。

4.非編碼RNA

調控有多種功能性非編碼RNA可對基因表達水平進行干擾。各種生物中雙鏈RNA（dsRNA）可通過不同途徑被分割成小的干涉RNA（siRNA）或RNAi。RNA干涉（RNAi）屬于轉錄后基因沉默，它可使轉錄后的同源mRNA降解，使同系的DNA序列發生修飾性變化（甲基化），使rRNA甲基化，從而使目的基因表達沉默。

5.副突變

副突變是指一個等位基因可以使其同源基因的轉錄產生穩定可遺傳變化，即一個等位基因被另外一個等位基因在轉錄水平上被沉默且這種能力可遺傳。這種現象是1956年R.A.Brink在研究玉米的R基因座位時發現的。此后在其他植物、真菌甚至小鼠中發現。

二、遺傳學和表觀遺傳學的關系

傳統遺傳學認為遺傳信息儲存于DNA的序列中，它主要研究基因序列改變所致的基因表達水平的變化，是基因質的變化;表觀遺傳學則認為遺傳信息是DNA甲基化形式和組蛋白密碼、RNA干涉等，它實際上是以基因表達水平為主的量變遺傳學。表觀遺傳變異也能遺傳，并具重要的表型效應，但其不同于基因突變。在整個生命過程中，表觀遺傳學機制能對激素、生長因子等調節分子傳遞的環境信息在不改變DNA序列的情況下做出反應。因此，只有二者彼此協同，生命過程才能按序正常進行，否則就會出現異常。由此可見，遺傳學和表觀遺傳學系統既相區別、彼此影響，又相輔相成，共同確保細胞的正常功能。

三、表觀遺傳學研究的應用前景

表觀遺傳學補充了“中心法則”忽略的兩個問題，即哪些因素決定了基因的正常轉錄和翻譯以及核酸并不是存儲遺傳信息的唯一載體;在分子水平上，表觀遺傳學解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現象。例如，同一等位基因可因親源性別不同而產生不同的基因印記疾病，疾病嚴重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳學信息還可直接與藥物、飲食、生活習慣和環境因素等聯系起來，營養狀態能夠通過改變表觀遺傳以導致癌癥發生，尤其是維生素和必需氨基酸。

第2篇：表觀遺傳學主要研究范文

表觀遺傳學（epigenetics)是與遺傳學（genetic)相對應的概念，是對經典遺傳學的有益補充；其認為在不改變基因序列的條件下，生物體從基因到基因表型之間存在一種調控，這種機制即“表觀遺傳學”的含義。盡管已被提出70余年,但直到近10余年，隨著科學家們對這種“獲得性遺傳”的進一步認識，才成為生命科學界最熱門的研究之一。因此,研究者們轉換思維，從表觀遺傳學角度對AD發病及治療進行了研究，發現了一系列表觀修飾的關鍵酶類，以及對這些酶類發揮影響的藥物，從而為AD藥物研發提供了新的思路和研究方向。本文擬就AD的表觀遺傳學治療研究綜述如下。

1阿爾茨海默?。ˋD)概況

阿爾茨海默?。ˋD)是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病。它是最常見的癡呆類型，西方國家[中50%?70%的癡呆屬于AD。其病因及發病機制復雜，涵蓋了遺傳和環境的危險因素，涉及成千上萬個基因表達的改變，以及多種信號途徑的上調，如P淀粉樣肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥、氧化應激、能量代謝、血管因素及細胞凋亡周期異常等。ad的典型病理改變包括突觸喪失、某些神經遞質水平下降、神經元內異常物質沉積以及選擇性腦神經細胞死亡，使大腦受累區域廣泛萎縮，導致記憶力喪失伴行為改變和人格異常，嚴重者可影響工作及社會生活。受累區域常會出現A沉積、老年斑（senileplaques,SP)、神經原纖維纏結(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白過度磷酸化等。疾病逐漸進展惡化，甚至累及生命。遺憾的是目前尚缺乏延緩或阻礙疾病進展的治療手段。

在AD中，涉及神經元退行性改變的基因達200余個,越來越多的研究數據發現在沒有基因序列改變的情況下，某些機制也可以決定致病基因何時或怎樣表達，最終導致AD發病。因此，AD基因組并不能完全解釋發病機制[14]。已知編碼APP、PSEN1和PSEN2的基因僅可導致家族性早發型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多數（約95%)AD均為晚發型AD(late-onsetAD,LOAD)或散發型。因此可以推斷，表觀遺傳現象或環境因素參與了LOAD的致病。這就部分解釋了為什么同一家族中有的家庭成員發病而另一些不發??；而且，在年輕的同卵雙胞胎中基因組無實質上的差異，而在同一老年雙胞胎中其基因表觀遺傳學上存在顯著差異。

大量研究數據證實，基因-環境相互作用在AD的病理生理過程中發揮了關鍵作用營養物質、毒素、環境暴露及人的生活行為,都可以在不改變基因組序列的條件下使基因激活或沉默。目前已知的可調控基因轉錄和表達的表觀遺傳學機制主要分兩大類：①基因選擇性轉錄的調控：包括基因組DNA甲基化，多種組蛋白甲基化及乙?；刃揎?；②基因轉錄后的調控：包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非編碼RNA的調節，以及沉默的核糖體RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外，染色體重塑、基因印記、X染色體失活也屬于表觀遺傳學范疇。

2表觀遺傳學

表觀遺傳學的涵義即在DNA序列不發生改變的情況下，基因的表達與功能發生改變，并產生可遺傳的表型?；緳C制即：通過多種基因修飾，影響基因轉錄和（或）表達，從而參與調控機體的生長、發育、衰老及病理過程。至此，表觀遺傳學的發現極大豐富了傳統遺傳學的內容，使人們認識到遺傳信息可以有兩種形式：即DNA序列編碼的“遺傳密碼”和表觀遺傳學信息。它和DNA序列改變不同的是,許多表觀遺傳的基因轉錄和表達是可逆的，這就為許多疾病的治療開創了樂觀的前景。

2.1組蛋白修飾

組蛋白在DNA組裝中發揮了關鍵作用，利用核心組蛋白的共價修飾傳遞表觀遺傳學信息。這些修飾主要包括組蛋白甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸殘基N-末端的SUMO化;其中組蛋白氨基末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是修飾的主要靶點,這些組蛋白翻譯后修飾(post-translationalmodifications,PTMs)對基因特異性表達的調控，是其表觀遺傳學的重要標志。正常機體內，組蛋白修飾保持著可逆的動態平衡。一般而言,組蛋白乙酰化是在組蛋白乙酰轉移酶（histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下，從乙酰輔酶A上轉移乙?；浇M蛋白N-末端的賴氨酸殘基上；由于乙酰化中和了組蛋白的正電荷，使組蛋白末端和相關DNA帶負電荷磷酸基團之間的作用減弱，降低了組蛋白和DNA之間的親和力，這種染色質構象的放寬有助于轉錄因子向靶基因片段聚集并利于轉錄的進行。而去乙?；瘎t是組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs)將乙酰基從乙酰化組蛋白轉移到乙酰輔酶A上，形成了致密的染色質狀態，從而使基因轉錄下降或沉默。

2.2DNA甲基化

DNA甲基化較組蛋白修飾更進一步，是表觀遺傳學的又一重要機制。DNA甲基化主要是在DNA甲基轉移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下，將同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循環中S-腺苷甲硫氨酸（SAM)中的甲基，由四氫葉酸轉移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC)。其中，相鄰的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpGs)是最主要的甲基化位點。在人類基因組中，CpG以兩種形式存在：一種分散存在于DNA中，其CpG70%?90%的位點是甲基化的；另一種CpG呈密集分布于一定區域，稱之為“CpG島”（CpGislands),通常位于或接近基因啟動子區（promoterregions),在正常人體基因組中處于非甲基化狀態。CpG島中的胞嘧啶甲基化可以阻礙轉錄因子的結合，從而可致基因沉默。一般而言，高度甲基化的基因可致表達抑制,而低甲基化的基因可增強基因表達或過表達。

2.3非編碼RNA

表觀遺傳學調控機制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及維持細胞周期的沉默rRNA基因的一部分。

miRNA是較短的雙鏈RNA分子，約有22個核苷酸，來源于機體自身基因即細胞核及細胞質中較大的RNA前體，有自己的啟動子和調控元件。人類基因組中有約700?800個miRNA。這些小分子RNA在轉錄后通過綁定靶mRNA,從而抑制轉錄或誘導mRNA分裂降解。大多數miRNA具有高度保守性和組織特異性，可以調控機體中30%?50%的蛋白質編碼基因。siRNA長短與miRNA相似，作用方式也有很多相同之處，區別在于siRNA可以體外合成,多由外源性導入或感染誘導產生。

重復rRNA基因的復制為真核生物核糖體提供了初始活性位點，在基因表達中是蛋白質合成的熱點區。不同細胞類型可表現不同的活性rRNA比率,提示隨著細胞發育分化，rRNA基因拷貝數比例會發生改變。沉默rRNA的表觀遺傳學方式在這個過程中發揮了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了動態平衡。

2.4染色質重塑、基因印記和X染色體失活

染色質重塑（chromatinremodeling)指基因復制、轉錄和重組等過程中，核小置和結構及其中的組蛋白發生變化，引起染色質改變的過程；主要機制即致密的染色質發生解壓縮，暴露基因轉錄啟動子區中的特定結合位點，使轉錄因子（transcriptionfactor,TF)更易與之結合。基因印記(geneticimprinting)指來自親本的等位基因在發育過程中產生特異性的加工修飾，導致子代體細胞中兩個親本來源的等位基因有不同的表達方式，即一個等位基因有表達活性，另一等位基因沉默。X染色體失活指雌性哺乳動物細胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現象,即X染色體被包裝成異染色質，進而因功能受抑制而沉默化，使雌性不會因為擁有兩個X染色體而產生兩倍的基因產物。

3AD的表觀遺傳學3.1組蛋白修飾

研究顯示，在AD中存在組蛋白的PTMs。組蛋白3(histone3,H3)磷酸化作為激活有絲分裂的關鍵步驟，可使AD海馬神經元呈過磷酸化狀態。對APP/PS1突變小鼠和野生型小鼠進行條件恐懼訓練,結果顯示前者乙?；疕4較野生小鼠組降低50%;之后對突變組進行HDAC抑制劑（histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治療，顯示前者乙?；疕4水平出現了上升。在一項皮層神經元培養模型研究中，APP過度表達則可導致H3和H4乙酰化降低，以及c-AMP反應元件結合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB則是腦神經元中激活記憶相關基因，形成長期記憶的關鍵蛋白。總之，盡管在AD患者、AD動物模型及AD培養模型中，都出現了組蛋白修飾,但這個過程是極其復雜的,特異性位點會因功能狀態不同而出現組蛋白乙?；黾踊驕p少。

3.2DNA甲基化

3.2.1相關基因的甲基化研究顯示，盡管很難判

斷AD中甲基化程度是升高還是下降，但12個甲基化的AD特異性基因表現出了顯著的“表觀偏移”；同時研究還發現，在DNMT1啟動子內一些CpG位點也表現出年齡相關的表觀偏移。研究還發現，葉酸、甲硫氨酸及Hcy代謝與DNA甲基化機制顯著關聯。例如，人類及動物模型葉酸缺乏將導致基因組整體低甲基化，而補充葉酸則可部分逆轉甲基化程度。Smith等研究發現，衰老及AD人群中都出現了葉酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改變。另一研究發現AD患者腦脊液（cerebro-spinalfluid,CSF)中葉酸顯著下降，同樣下降的還有CSF及腦組織中SAM。同時還觀察到AD患者腦組織中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血漿中Hcy的升高，后者可抑制DNA甲基化。

目前已知的AD相關基因主要包括：p淀粉樣蛋白前體（APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、載脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶（BACE)基因、sortilin相關受體基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中，APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可調控的CpG甲基化位點。有研究顯示,一例AD尸檢的大腦皮層中APP基因發生了完全去甲基化，而正常樣本或匹克氏?。≒ick’sdisease)患者樣本則沒有這種變化。實驗發現，葉酸缺乏所致的BACE和PS1基因表達增強，可通過補充SAM而恢復正常。同樣，體內實驗發現，給予APP過度表達的轉基因小鼠缺乏葉酸、B12及B6的飲食，可以使SAH升高并上調PS1和BACE的表達，以及促進A的沉積和出現認知障礙。在LOAD尸檢標本中，研究者發現了著名的“年齡依賴的表觀遺傳學漂移”(age-dependentepigeneticdrift);對CpG島異常的表觀遺傳學控制,可能促成了LOAD的病理變化,因此，“表觀遺傳學漂移”可能是LOAD個體易感的重要機制。

3.2.2Tau蛋白相關的甲基化Tau蛋白是一種微管結合蛋白（microtubulebindingprotein,MAP),它能與神經軸突內的微管結合，具有誘導與促進微管形成，防止微管解聚、維持微管功能穩定的功能。對記憶和正常大腦功能起重要作用。然而，在AD中,Tau蛋白不僅不再發揮正常功能，還會因異常磷酸化或糖基化等改變了Tau蛋白的構象，使神經元微管結構廣泛破壞，形成以Tau蛋白為核心的NFT,最終導致神經元功能受損或神經元丟失。

人體在正常條件下，Tau蛋白啟動子的AP2結合位點是非甲基化的，但SP1和GCF結合位點則被甲基化。而隨著年齡的增加，SP1作為一種轉錄激活位點甲基化程度升高,GCF作為啟動子抑制位點則逐漸去甲基化，因此總體而言Tau蛋白的基因表達是下調的。尤其在額葉及海馬區域，正常Tau蛋白也出現了年齡相關的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一種針對磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶，PP2A催化亞基的甲基化可以激活該酶。研究顯示，在APP及PS1基因突變的轉基因小鼠中，PP2A的甲基化程度顯著下降，結果顯示Tau蛋白磷酸化增高。對培養的神經元添加葉酸拮抗劑甲氨蝶呤，也可導致PP2A去甲基化，從而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外，還有研究顯示，Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加葉酸和B12則可以逆轉這個過程。總之，Tau蛋白的磷酸化和脫磷酸化間平衡是維持微管穩定性的關鍵因素；而其中磷酸化相關酶類的甲基化程度,成為影響Tau蛋白磷酸化的重要因素。

3.2.3異常的細胞周期和神經元凋亡研究證實,細胞周期異常和神經元凋亡是AD神經退行性變的常見機制。AD神經元中細胞周期及凋亡途徑關鍵因子受DNA甲基化影響并發生上調。包括細胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。這些相關基因的低甲基化使細胞進入異常細胞周期。同樣,高Hcy可使培養神經元凋亡，也間接證實了低甲基化導致異常細胞周期；而使用SAM還可起到拮抗細胞凋亡的效果。

3.3A與miRNA

研究發現，miRNA可以調節APP的表達、APP處理、A聚積以及BACE1的表達，從而導致A毒性改變或影響神經再生。因而,miRNA失調可使APP表達及處理過程發生改變，最終引起神經元存活率和神經再生程度的改變。針對全球AD人群和正常老年人群的對比研究發現，特異性miRNA水平存在顯著差異。研究顯示，在AD中APP相關miRNA顯著下降，而APPmRNA水平則保持平穩，提示miRNA影響APP表達是通過抑制轉錄而不是促進APPmRNA的裂解；同時，在AD皮層中miRNA-106b出現顯著下降。具體機制還有待進一步研究。

3.4AD與一碳代謝

葉酸代謝又稱為一碳代謝，需要SAM提供甲基。諸多研究表明,AD患者常存在血漿及CSF中Hcy升高（兩者濃度升高常呈正相關)，血漿葉酸和B12水平下降，以及腦組織中SAM減少。早期暴露于缺乏葉酸及B族維生素飲食的動物，其AD相關基因在腦組織中發生了表觀遺傳學修飾。SAM作為甲基化過程最重要的甲基來源，其產生及循環依賴于甲硫氨酸循環的正常進行[11]。研究顯示,AD患者CSF中SAM出現顯著下降，口服SAM(1200mg,qd)4?8個月,可以使CSF中SAM濃度升高。同時，維生素B12缺乏可使SAM產生減少，從而影響甲基化。前瞻性隊列研究表明，高Hcy與AD高風險顯著相關，而較高的葉酸攝入量可以降低老年人的AD風險。葉酸缺乏導致的SAM缺乏以及Hcy升高，使甲基化水平下降；并且，Hcy影響SAM和SAH水平，后兩者可調節DNA甲基化活性以及蛋白翻譯后修飾。另外，研究還發現Hcy可通過抑制甲基化，降低PP2A甲基化程度，從而導致Tau蛋白過磷酸化、NFT及SP形成。因此，最關鍵機制即：葉酸/同型半胱氨酸代謝異常導致AD相關基因啟動子的表觀遺傳修飾（CpG區域甲基化狀態的改變)，使基因沉默（高甲基化）或過度表達（低甲基化)，最終發生AD。

4表觀遺傳學在AD診療中的應用研究

近年來，隨著表觀遺傳學在AD研究中的不斷進步，研究者已逐漸將其應用于AD的診斷及治療中，盡管多數還處于臨床前試驗階段，但表觀遺傳學應用于AD臨床的前景是樂觀并值得期待的。

4.1表觀遺傳學診斷手段

利用亞硫酸氫鈉進行甲基化測序是檢測DNA甲基化的金標準。該方法利用鹽析法從血液中提取基因組DNA,經過亞硫酸氫鹽處理后，變性DNA中胞嘧啶轉換為尿嘧啶，而5-mC則不發生轉換，因此在經過PCR擴增和DNA測序后，胸腺嘧啶則代表非甲基化胞嘧啶，而5-mC(主要為CpG二核苷酸）仍為胞嘧啶。繼而由該方法延伸出多個DNA甲基化分析法，例如：甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、結合亞硫酸氫鹽限制性分析（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性單核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而，由于目前對AD相關基因甲基化的研究還不完善，只能在臨床前研究中應用甲基化測序，用于對比分析AD中基因甲基化的真實狀態。

實時基因成像（real-timegeneticimaging)技術是另一種判斷基因表觀遺傳修飾的手段；該技術避免了尸檢或動物研究，是一種新型的非侵入性的可視化基因調控檢測。磁共振波譜（MRspectroscopy,MRS)即是這樣一種特殊的磁共振成像，該技術可掃描到特定的蛋白，將來可使我們能夠實現對基因表達變化的可視化實時檢測，理論上而言可以追蹤到DNA甲基化或組蛋白修飾的責任蛋白；因此，在一定程度上，將為AD的表觀遺傳學診斷和治療提供新的手段[39]。

此外，另有研究發現，脂肪酸酰胺水解酶（fattyacidamidehydrolase,FAAH)參與了AD的發病，同時還發現FAAH易于從外周血中檢出，并可作為一個新的潛在的AD生物標志物（biomarker),繼而用于AD的預測或診斷。然而，由于一些AD相關蛋白或酶類在外周血中易降解，穩定的miRNA檢測已成為反映疾病的重要手段。由于大多數AD患者外周血單核細胞中存在各種miRNA的表達上調（如miR-371、miR-517等),且與其在AD腦中高表達相對應，提示通過測定血漿及血單核細胞的miRNA譜變化,可作為AD診斷和病情評估的重要方法。

4.2AD的表觀遺傳學治療

表觀遺傳學對研究AD的發病機制和病程轉歸,以及研發新的藥物等方面開拓了廣闊的空間。表觀遺傳學藥物進入體內后，可充當基因轉錄或表達的“開關”，通過不同的基因修飾及調控基因表觀修飾相關酶類的活性，繼而達到在未改變DNA序列的情況下影響基因表型。因此，正是表觀遺傳學改變的“可逆性”，使與之相關藥物的研發成為AD治療研究的新方向和重點。

4.2.1HDACIs近年來，科學家們研發了多種新的HDACIs。根據化學形態主要分為4類：①短鏈脂肪酸類：如丁酸鈉、苯丁酸鹽和丙戊酸（valproicacid,VPA);②異輕肟酸（hydroxamicacid)類：如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺異輕肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③環氧酮類：如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺類：如MS-275。這些HDACIs與鋅依賴性HDAC蛋白（zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV類組蛋白亞型）相互作用；煙酰胺作為NAD+前體，可以抑制III類HDAC蛋白。其中，研究最廣泛的是丁酸鈉、苯丁酸鹽、VPA、TSA和SAHA。

目前FDA批準上市的是SAHA,-種治療T細胞淋巴瘤的新型化合物，不僅可增加組蛋白乙?；剑瑫r還可提高認知。在神經系統中，VPA具有抗驚厥和穩定情緒的作用，因此這些作用可能與引起組蛋白乙?；淖冇嘘P；VPA還可以通過抑制GSK-3#介導的y-分泌酶裂解APP,從而抑制Ap的產生，減少A斑塊，最終緩解AD模型鼠的認知功能障礙。Ricobaraza等研究顯示，4-苯基丁酸乙酯（PBA)可通過降低GSD-3#來降低AD大鼠腦內Tau蛋白磷酸化，并可清除突觸間A沉積，減輕內質網壓力，從而恢復記憶并逆轉學習障礙。而煙酰胺則可選擇性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙酰化的a微管蛋白。Fischer等也研究發現，非特異性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸鈉及伏立諾他等，都可以通過不同的表觀遺傳機制影響Ap沉積和Tau蛋白過磷酸化，并可改善學習和記憶力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表達，減輕大腦中的A肽斑塊負擔；研究還證實，HDACI治療還可誘導樹突發芽，增加突觸數量，以及恢復學習行為和形成長期記憶。Zhang等報道，口服HDACIMS-275可改善神經炎癥和腦淀粉樣變，以及改善AD模型動物的行為能力。這些研究提示,HDACIs可通過調節HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平，從而用于AD的治療.

HDACIs可選擇性抑制HDACs,導致組蛋白乙?；缴撸謴虯D模型動物中組蛋白乙?；郊疤岣邔W習和記憶能力。例如：Guan等發現當腦內HDAC2過表達時，小鼠海馬神經元樹突棘密度降低、突觸形成減少、CA1區LTP形成障礙、空間記憶和工作記憶損傷；而使用HDACIs則能夠促進小鼠神經元樹突棘和突觸的形成，改善AD模型小鼠的學習和記憶減退狀態。因此，HDAC2可能是HDACIs最適宜的治療靶點之一，可能使腦神經元內合成新的蛋白以改善或恢復AD患者記憶。除此之外,HDACIs對基因表達的調節具有特異效應,可以在上調靶基因表達的同時下調其他基因;這種基因特異性常通過轉錄因子來調控，后者可以識別特定啟動子和增強子序列，并賦予靶基因特異性（gene-specificeffects),使之對HDACIs具有敏感性[44],繼而逆轉表觀遺傳改變。同時，應用HDACIs治療AD還應當考慮其是否可穿透血腦屏障，因此，最近的一項研究研發了一種可進入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I類）EVP-0334,目前已進入I期臨床試驗用于AD治療。

眾所周知，AD大腦受累的主要區域為內側嗅皮質、海馬及杏仁核等。研究發現，與正常腦組織相比,AD患者皮質中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海馬中則升高了92%。HDAC6與Tau蛋白共同存在于核周，并發生相互作用；其中HDAC6具有獨立的微管蛋白脫乙?；傅幕钚?。使用HDAC6抑制劑Tubacin治療或敲除HDAC6,并不能影響HDAC6與Tau蛋白的相互作用，但可以減少Tau蛋白磷酸化[55]。通過結合HDAC6,Tau蛋白可抑制脫乙酰酶活性,從而導致微管蛋白乙?；黾?；在Tau蛋白過表達的細胞中也可見這種增加；說明過量的Tau蛋白成為HDAC6的抑制劑，然而AD患者中正常Tau蛋白是減少的。文獻顯示，HDAC6的減少或丟失可改善聯想和空間記憶形成[56,57],以及阻斷A誘導的海馬神經元線粒體運輸障礙。最近有研究人員還發現,HDAC6無效突變（nullmutation)可以挽救神經元中Tau蛋白誘導的微管缺陷。他們采用遺傳和藥理學方法抑制HDAC6的tubulin特異性脫乙?；富钚?，證實這種“挽救效應”有可能是通過增進微管乙?；閷У摹＿@些研究結果表明,HDAC6有可能是AD和相關Tau病的一種獨特的有潛力的藥物靶點,HDAC6抑制劑有望成為AD治療的新型藥物。

目前研究證實，HDACIs可用來治療神經變性病、抑郁、焦慮情緒、認知功能障礙及神經發育障礙,因此為AD的治療提供廣闊的前景。但現有的HDACIs存在生物利用度低、代謝快、低選擇性等缺點。因此,研究開發結構新穎、副作用小、特異性及選擇性高的HDACI具有重要的臨床意義。

4.2.2飲食因素除此之外，飲食因素，例如葉酸、維生素B2、B6、B12、蛋氨酸、膽堿等都可以影響甲基供體SAM的形成，并影響DNMTs活性；同時，一些天然化合物，如異黃酮、黃酮、兒茶素、姜黃素、白藜蘆醇等，可以改變表觀遺傳學機制,影響染色質修飾酶的活性，因此備受關注。

研究證實，傳統用于抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡及預防高脂血癥的姜黃素，也可用于治療AD：在體外實驗中，姜黃素可抑制A聚集沉積、A#誘導的炎癥、戶分泌酶及乙酰膽堿酯酶的活性；而體內實驗則證實，口服姜黃素可抑制AD動物腦組織中Ap沉積、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化，并改善行為及認知。另有研究發現，姜黃素還可加速淀粉樣斑塊的分解，繼而改善AD的空間記憶障礙。據Bora-Tatar等[65]報道，在33種羧酸衍生物中，姜黃素是最有效的HDAC抑制劑，甚至比丙戊酸和丁酸鈉更強效；另有研究也發現，姜黃素可顯著降低HDAC1、3和8蛋白水平，并可提高乙?；疕4水平。同時，姜黃素還是潛在的HAT抑制劑，2004年Balasubramanyam等[66]發現，姜黃素是p300/CREB結合蛋白HAT活性特異性抑制劑，對維持一定的CREB水平起到關鍵作用。因此，姜黃素對HDAC和HAT均有調節作用；作為已知的抗氧化劑，姜黃素可能是通過調節氧化應激，從而對乙酰化和去乙酰化具有雙重調節作用。

AD表觀遺傳學改變受環境、營養因素等諸多因素共同作用，因此自孕前保健開始,直至子代的一生，都保持機體內外生存環境的良好，保證表觀遺傳學正常修飾及表達,在一定程度上可能會預防AD的發生。同時，由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血壓等都是公認的AD高危因素，通過表觀遺傳學機制防治這些疾病，也是降低AD的發生風險的重要手段。另外，提倡低熱量、低膽固醇和富含葉酸、B族維生素及姜黃素等的飲食，以及降低血漿Hcy值，可能對保護大腦神經元，改善老年期認知，以及預防AD發生或逆轉AD的表觀遺傳改變，起到一定的積極作用。

4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的，該過程的相關酶類也可作為AD治療的研究靶點,例如DNMT抑制劑。然而，目前對DNMT抑制劑的研究多局限于腫瘤的治療，因此對于AD的治療作用還有待進一步研究。另外，研究發現AD中與APP裂解機制相關的多個miRNA也發生了改變,因此針對miRNA的AD表觀遺傳治療成為重要研究方向。2006年，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所裴鋼院士研究組研究發現，腎上腺素受體被激活后，可以增強y-分泌酶的活性，進而能夠增加AD中Ap的產生。這項發現揭示了AD致病的新機制，提示腎上腺素受體有可能成為研發AD治療藥物的新靶點。

5展望

綜上所述，在AD中，表觀遺傳學機制對疾病發生發展起到了關鍵作用，尤其是散發性AD。表觀遺[8]傳學調節障礙導致相關基因轉錄異常，引起關鍵蛋白或酶類異常，繼而發生一系列病理生理改變，是AD發病的主要原因。表觀遺傳學改變可以通過表觀遺傳藥物進行逆轉，因而這不僅為AD的治療開創了一片新天地，更引導醫藥行業進入了一個嶄新的領域。

然而,使用表觀遺傳學藥物治療疾病也面臨著一系列難題。對于目前可用的表觀遺傳學化合物如HDACIs及辣椒素等而言，主要的困難即缺乏針對不同腦區、不同神經元亞型或特異基因的“選擇性”。

第3篇：表觀遺傳學主要研究范文

【關鍵詞】 急性髓細胞白血??； 表觀遺傳學； 靶向治療

急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組異質性疾病，以造血干細胞克隆紊亂為特征，是成年人急性白血病中最常見的類型。近20年來，人們對AML的發病機制和預后的研究有了長足的進展，患者的完全緩解率也有了明顯的提高，但仍有2/3成年AML患者未能達到治愈，復發、難治及老年AML仍是目前臨床治療的難題。為此，臨床工作者和科研人員不斷探索新途徑，積極尋求AML治療新方法。

近年來，表觀遺傳學的研究逐漸成為人們關注的熱點。隨著研究的深入，人們對AML的發病機制有了新的認識，隨之而來的靶向治療也給患者重新帶來希望。該研究主要包括三個方面的內容：DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼microRNA。研究表明，表觀遺傳學的調控機制參與調節許多重要的生理過程。在血液腫瘤的發生和轉化中，表觀遺傳學異常與遺傳學異常具有同樣重要的作用。表觀遺傳基因的修飾對于基因的差e表達有著至關重要的作用，它決定著細胞的類型及細胞從良性到惡性的轉變。尤為重要的一點，這種修飾是可遺傳的、動態的、可逆的，并且不影響下游的DNA序列。表觀遺傳的修飾基因，如DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2，ASXL1和MLL1上的頻發突變，影響了造血細胞的自我更新和/或分化能力，促進髓系細胞的轉化，促進白血病的形成[1]。表觀基因組在AML的發生中有重要的靶標性作用，它具有內在可塑性，通過特異性的酶、轉錄因子、與表觀遺傳機制相關的其他蛋白重新編碼對表觀遺傳基因的修飾，為治療提供了新的可能。

本文將描述表觀遺傳基因的失調是如何在AML中發揮作用的，同時強調目前和未來的治療手段在發現新靶標上的多種嘗試。此外，還將涉及AML中個體化的靶向治療，包括術語的定義，適應證的相關描述以及臨床實施的具體措施。

1 表觀遺傳學的針對性治療

1.1 DNMT3A突變及DNMT抑制劑 DNA甲基化是表觀遺傳調控的重要組成部分，通常與轉錄沉默有關。在急性白血病中，已被確定多種腫瘤抑制基因的過甲基化與轉錄抑制通過增殖、分化和生存過程的失調導致白血病的發生[2]。來自MDS的DNA甲基化譜研究數據顯示，抑癌基因的異常甲基化可能是驅動MDS進展為AML的主要機制[3]。胞嘧啶甲基化是指C5位的胞嘧啶殘基被DNA甲基轉移酶（DNMTs）催化，并生成C5甲基胞嘧啶（5-MC）的過程。基因組DNA甲基化是由DNMT3通過半甲基化的模板（從頭甲基化）建立的，并由DNMT1全甲基化模式（維持甲基化）予以保持。這些過程使得不同的可遺傳的DNA甲基化模式可以用來區分AML亞型、預測預后，并有潛力作為生物標志物來預測患者對治療的反應[4]。AML要么普遍低甲基化，要么過甲基化，這提示表觀遺傳途徑的過度和不足可能對白血病的發生都很重要[5]。數據表明，在白血病干細胞中，DNMT1可維持其DNA甲基化模式，并參與其自我更新的過程[6]。研究表明，DNMT3A在造血干細胞自我更新和分化過程中起著關鍵的作用。重要的是，DNMT3A的功能缺失性突變發生在30%的細胞遺傳學正常的AML中，可能與臨床預后較差有關，但AML的這些突變對于DNA胞嘧啶甲基化和轉錄的影響尚不清楚，且DNMT3A的單獨缺失并不足以導致白血病形成[7]。大多數的突變涉及882位的精氨酸，在體外導致甲基轉移酶活性的降低[8]。到目前為止，尚無特異性針對DNMT3A的靶向治療。本節討論的“表觀遺傳修飾的靶向治療”指的是針對DNMT抑制劑的去甲基化治療。

美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的2種DNMT抑制劑為：阿扎胞苷及其脫氧衍生物地西他濱。這兩種藥物均用于MDS的治療，現在依據一些臨床試驗的結果，也普遍應用于AML的治療。

在一項多中心Ⅱ期研究中，有227位初治AML患者接受了地西他濱治療。每個療程中靜脈滴注地西他濱持續72 h，用量為135 mg/m2，間隔6周重復用藥，共4個療程[9]。該研究表明，總體有效率為26%，中位生存期為5.5個月，1年存活率為28%。在另一項多中心Ⅱ期臨床試驗中，給予55位60歲以上的AML患者靜滴地西他濱治療，每日用量為20 mg/m2，連續5 d給藥，每4周為一療程。結果，該試驗中AML的完全緩解率為24%，中位生存時期為7.7個月。

在一項針對高危MDS（包括骨髓中原始細胞比例為20%～30%、根據WHO標準應列為AML）的臨床試驗中，給予患者阿扎胞苷治療：每日用量為75 mg/m2，連續7 d皮下注射用藥，28 d為一個療程。與對照組（接受傳統治療方案）相比，阿扎胞苷組有明顯的生存獲益。而對于一些次要的評價指標而言，比如輸血需求、靜脈抗生素的使用和住院天數等，阿扎胞苷組有明顯優勢。與之類似的是，在法國的一項臨床研究中，149名初治老年AML患者接受了相同劑量和療程的氮雜胞苷治療，總體有效率為33%，完全緩解率為23%，總體生存期為9.4個月[10]。對于接受了大劑量誘導化療和異基因造血干細胞移植的AML患者，使用阿扎胞苷維持治療可能會減少或延遲白血病的復發。

1.2 IDH1/2突變及IDH1/2抑制劑 DNA甲基化與同型二聚體酶IDH1/2催化的檸檬酸代謝有關，二聚體酶可催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸（α-KG）。研究發現，有10%～30%正常核型的AML患者發生了IDH1/2功能突變，引起酶功能異常，導致2-羥基戊二酸（2-HG）的產生和積累。由于TET2和包含jumonji-c結構域家族的組蛋白賴氨酸去甲基化酶均依賴于α-KG，當機體發生IDH1/2突變，并積累2-HG，可導致DNA和組蛋白甲基化的增加[11]。IDH1/2突變對預后的影響研究得到了自相矛盾的結果，可能是因為突變位置的差異和（或）伴隨其他基因的突變。例如，一項關于AML的隨機臨床試驗表明，IDH2的第140位的精氨酸殘基發生突變與良好的預后相關。不但如此，同時伴有NPM1和IDH1或IDH2突變的細胞遺傳學正常的AML患者也有良好的受益，3年總生存率（OS）可高達89%。然而，IDH1/2和TET2突變是相互排斥的，但具有這兩種不同的突變的AML患者具有相似的甲基化過程。

目前，一項早期臨床試驗正在進行，旨在研究IDH1/2抑制劑對發生了IDH1/2突變的AML患者的影響。這是一種針對IDH1/2突變酶的小分子靶向抑制劑，可減少2-HG的生成，誘導H3K9me3的脫甲基作用，并能增強相關分化基因的表達[12]。

1.3 MLL基因突變及DOT1L蛋白甲基轉移酶抑制劑 MLL基因位于染色體11q23，編碼H3K4甲基轉移酶（HMT），該酶參與組蛋白的重構，影響HOX基因和Wnt信號通路[13]。有5%～7%的初發AML病例發生MLL重排，與不良預后相關[14]。MLL區域是染色體易位和重排的高發區，能產生多種融合蛋白，其中一些有致癌性。研究顯示，MLL融合蛋白和DOT1L之g的作用導致了白血病的發生[15]。

已有研究表明，DOT1L HMT的酶活性誘導了存在MLL基因重排的AML的形成。DOT1L抑制劑可減少H3K79的甲基化和MLL融合基因的表達。目前，具有高度選擇性的DOT1L抑制劑的研究已進入臨床試驗階段，而選擇性抑制HMT EZH2的強效抑制劑也正在研究中。

1.4 組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑 單獨使用HDAC抑制劑治療AML，其臨床作用并不令人滿意。因而，能否與DNMT抑制劑聯合使用增強療效，則備受期待。目前，諸多相關的臨床試驗正在開展當中，而且對多種HDAC抑制劑，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立諾他等，與阿扎胞苷或地西他濱聯合使用的療效進行了評價，但結果并不如人意。在一項二期臨床試驗中，恩替諾特聯合阿扎胞苷治療AML并未提高療效[16]。需要注意的是，與早期的體外試驗采用序貫用藥不同，此項試驗中這兩種藥物是同時應用的。恩替諾特是一種強效的細胞周期抑制劑，可能會抑制阿扎胞苷的整合，導致脫甲基作用減弱。

1.5 賴氨酸乙酰化抑制劑 具有布羅莫結構域的蛋白質可識別組蛋白末端的賴氨酸殘基，這種相互作用可被小分子抑制劑所抑制。當前，已開始對數種BET抑制劑進行臨床試驗。研究表明，BET抑制劑可抑制白血病干細胞和祖細胞增殖，并且可阻斷MLL介導的白血病轉化[17]。

1.6 賴氨酸去甲基化酶抑制劑 研究結果顯示，KDM1A/LSD1在體外可有效抑制AML細胞系和原代白血病細胞。在聯合使用HDAC抑制劑和全反式維甲酸時，這種抑制作用更顯著。研究表明，MLL白血病受其影響最大，AML的其他亞型和其他髓系腫瘤也對之敏感[18]。

2 表觀遺傳學發展在AML靶向治療方面的挑戰

2.1 靶向治療的治療靶點 AML在發生、發展過程中有一系列的異常表現，就疾病本身而言，有許多方面的異?？梢赃M行針對性的治療，包括表觀遺傳途徑的調節、基因突變、細胞表型、信號轉導通路、白血病干細胞和骨髓微環境等。最近有關AML克隆構型的研究表明，AML克隆異質性始終伴隨著疾病的進展及復發[19]。因而，AML的治療靶點是不斷變化著的，在疾病的不同時期需用不同的藥物進行治療。有關初發AML克隆構型的研究顯示，在基因層面界定的白血病亞克隆和白血病干細胞之間具有明顯的功能異質性[20]。目前的挑戰是明確和清除所有的克隆，而非以往那樣狹隘地認為，靶向治療的關鍵就是應用某種方法，通過單向靶點來消除優勢克隆。

2.2 靶向治療的對象 如何選擇靶向治療的對象是一個比較重要的問題。根據不同的分類方法，AML患者可劃分為不同的亞群，但這樣的分類方法均有各自的優點和不足之處。

AML患者也可以根據預后進行分類。在過去，對新藥的早期試驗通常在復發和難治病例中進行，顯而易見，這是一種很令人困惑的試驗模式。由于復發或難治AML病例與初發病例在生物學上和臨床上是不同的，因而對初發病例作新藥研究十分重要。可以根據細胞遺傳學、分子遺傳學和表觀遺傳學數據，對初診患者進行風險評估并預先判斷其治療效果的優劣。例如，一項研究表明，在不同的甲基化區域，有高水平甲基化的7個基因其低表達具有更好的臨床結果[21]。目前認為，在臨床研究中，靶向治療的對象應該是那些預后可能不良的初發AML病例。

2.3 靶向治療的時機 臨床上通常將AML治療分為誘導、鞏固和緩解后治療。臨床研究表明，把針對表觀遺傳學調控的靶向藥物與其他藥物聯合使用，結果比單一用藥效果更好。因此，已考慮將試驗新藥添加到主流的誘導方案當中來。多年來有關AML治療的臨床實踐表明，尚無哪一種化療方案更優于阿糖胞苷聯合蒽環類藥物的“7+3”經典方案的，所以應把該方案作為主要的誘導方案，新藥可以添加于此或者作為單藥評估其療效。這樣，納入臨床試驗的初治患者將會接受其一進行治療。

各種證據表明，誘導后殘留的白血病細胞與治療前的腫瘤細胞在生物學上是有區別的。因此，臨床上重復應用同一治療方案并不合理。研究表明，表觀遺傳學靶向治療在AML完全緩解后或移植后，或可控制白血病克隆的演變。目前，多數靶向治療藥物是非細胞毒性的，對低負荷白血病而言，治療成功的可能性更大。當然，還需要更多的AML患者參與到臨床試驗中來，進行新型藥物的有效性驗證。

2.4 靶向治療的有效性評價 表觀遺傳學靶向治療一般需要長達幾周甚至幾月的時間方顯成效。此外，基于形態學和免疫表型的分析方法并不能有效評價靶向治療的療效。因而，可以憑借DNA甲基化特征、基因表達譜、高光譜測定法以及其他技術手段來做生物學標志的鑒定，通過生物學標志能充分預測療效，并提高疾病監控能力。然而，在當前臨床實踐中，尚未能常規使用此類表觀遺傳學的生物學標志。

3 展望

隨著對AML表觀遺傳修飾基因突變的認識的深入，人們發現表觀遺傳學在AML生物學發生中起著復雜而重要的作用。AML的表觀遺傳學靶向治療策略已經改變了臨床應用，AML患者的個體化靶向治療將成為現實。然而，現實中還面臨著諸多挑戰，其中最大的挑戰就是AML生物學和患者本身的高度異質性。只有通過創新性的臨床試驗、可靠的科學研究和醫患的共同參與等努力，才可能真正實現AML患者的個體化治療。

⒖嘉南

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第4篇：表觀遺傳學主要研究范文

【關鍵詞】惡性腫瘤；表觀遺傳；甲基化；基因印記；微小RNA；組蛋白

【中圖分類號】R730.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）04-0017-02

隨著近年來分子生物學研究的不斷發展，人們已經認識到惡性腫瘤的遺傳和表觀遺傳的因素綜合作用導致了惡性腫瘤的發生。在分子水平上對于惡性腫瘤的研究發現幾乎所有腫瘤都能找到表觀遺傳水平的異常。惡性腫瘤的發生機制的研究對于早期診斷、治療以及提高生存率有極其重大的意義。

1.惡性腫瘤細胞的生物學性狀及特點

腫瘤是一種多基因，經歷多步驟突變所引起的細胞克隆性疾病，具有以下生物學特性：①分化不好，異型性大。②核分裂象多，可見病理性核分裂象。③生長速度較快。④浸潤性或外生性生長。⑤常見出血、壞死、、潰瘍形成等繼發改變。⑥對機體的影響較大，破壞原發部位和轉移部位的組織；壞死、出血，合并感染和惡病質也常發。

2.腫瘤的發生與表觀遺傳

傳統遺傳學認為腫瘤是多基因參與的疾病，通常是2個/2個以上癌/抑癌基因參與按一定方式組合的多基因、經歷多步驟突變所引起的細胞克隆性退化性疾病。主要基因：缺失、重排、斷裂、突變等?；蚋淖兊慕Y果就是原癌基因激活，抑癌基因失活，如結腸癌相關基因：APC，RAS，P53，DCC.腦膠質瘤相關基因：P53，Interferons，MTS1，MTS2，EGFR，肺癌相關基因：RAS，c-myc，Rb，P53等。

近期的研究表明，在相當一部分腫瘤患者的癌細胞中，其主要的基因是完整的，并沒有發現任何的變異，突變和缺失等，這些事實就提示我們重新思考惡性腫瘤的發生機制，是不是有什么比基因改變更為重要的因素導致了正常細胞的惡變。隨著后基因時代的到來和日益發展，人們越來越深刻的認識到，生物體除了具有編碼遺傳信息外，還存在大量隱藏在DNA序列之中或之外的遺傳信息，這些非編碼RNA、DNA甲基化和組蛋白共價修飾系統共同構成的組蛋白密碼等，統稱為表觀遺傳學信息 [1]。 此種遺傳方式稱為表觀遺傳方式，而研究表觀遺傳方式的學科稱之為表觀遺傳學[2]。表觀遺傳有三個特點①可遺傳性；②可逆的基因表達調節；③沒有DNA序列的變化或者不能用DNA序列變化來解釋。表觀遺傳的研究的具體內容主要包括：DNA甲基化、基因印記、DNA甲基化與轉座子的穩定性、組蛋白共價修飾、染色質重塑、假基因、基因組中的非編碼RNA、微小RNA、反義RNA、內含子、核糖開關。

2.1 DNA甲基化

對于不同腫瘤細胞的DNA分析表明，惡性腫瘤細胞中出現基因突變的概率要大大低于預期[3]而在轉錄組范圍內檢測結腸直腸癌中由啟動子高甲基化引起的基因表達的抑制，發現高達5%的已知基因在腫瘤細胞中發生了異常的啟動子高甲基化[4]。因此我們可以推測，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細胞惡變過程中可能發揮了更大的作用。

眾所周知，p53基因是一個重要的抑癌基因，對于畸變、損傷的細胞可引發其凋亡程序，使細胞發生凋亡，50%的惡性腫瘤中存在p53基因的沉默失活[5]。p53基因編碼區的甲基化狀態很容易發生脫氨基作用而發生5mCT的轉換。同時，INK4a/ARF基因啟動子區域的甲基化可以使p14ARF 表達下降，導致原來受p14ARF 抑制的MDM2表達上升，從而結合p53并使其發生蛋白質水平的講解，進而幫助細胞逃避p53引起的細胞凋亡[6]。近年來研究結果表明，肝癌細胞中端粒酶陽性率高達84%，明顯高于癌旁組織、肝硬變組織及慢性肝炎組織，而正常肝臟組織沒有端粒酶活性。端粒酶的重要成分人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）的活性與端粒酶活性高度相關。次研究中的肝細胞系L02中hTERT啟動子有甲基化修飾，其mRNA低水平表達，經5’-aza-dC去甲基化處理，hTERT mRNA可被上調，端粒酶活性也隨之上升，其mRNA高表達亦不受5’-aza-dC影響[7]。由此我們可以認為hTERT mRNA的低表達與啟動子甲基化修飾相關，從而導致惡性腫瘤的無限復制。鈣結合蛋白（S100A4）是S100A家族中的一個成員，在結腸，胃，胰腺，乳腺等惡性腫瘤中呈現高表達，并與腫瘤細胞的侵襲，轉移以及不良的預后有關，它能調控產生降解細胞外基質的酶，有利于細胞的運動侵襲擴散，是單個的惡變細胞穿過細胞外基質轉移到毛細血管和淋巴道。Xie R等研究表明，在子宮內膜中，S100A4過表達時由于啟動子區低甲基化造成的[8]。位于線粒體的BCL-2相關蛋白BNIP3，也是一個凋亡因子，可誘使缺氧損傷的細胞凋亡，但是BNIP3的啟動子區域也包含有CpG島，發生惡性變的細胞BNIP3啟動子區高甲基化會引起該基因的沉默，那么細胞液就可以逃避缺氧時的凋亡[9]。

2.2 組蛋白

組蛋白甲基化的失平衡與人類許多腫瘤相關，比如常見的乳腺癌、前列腺癌、肝癌等。失平衡的出現導致與這些惡性腫瘤相關的抑癌基因或者癌基因平衡的改變。眾所周知，EB病毒感染與鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的發生息息相關，其中EBNA2是EB病毒的核心抗原之一，LMP1（潛伏期膜蛋白1）是已確認的EB病毒編碼蛋白，有促癌的作用，二者在EB病毒相關的鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的發生中，主要在原始B淋巴細胞的分化和增殖過程中起作用。而最近的研究表明，組蛋白的甲基化的改變可導致EBNA2和LMP1基因轉錄能力的異常，從而影響EB病毒感染潛伏期細胞的致癌潛能。Chau等研究發現，EB病毒Ⅰ期潛伏期細胞中的H3K9高甲基化導致EBNA2和LMP1基因轉錄的抑制，致使其致癌能力下降。而H3K4的甲基化導致EBNA2和LMP1基因轉錄的激活，使得EB病毒Ⅲ期潛伏細胞致癌潛能提高。組蛋白去乙?；改苋〕鲑嚢彼釟埢系囊阴；?，是基因表達沉默，由此可見組蛋白的異常去乙?；赡茉从谝阴；柑禺愋韵陆?故組蛋白去乙?；傅母淖円鸾M蛋白活性的改變從而導致基因表達的沉默，如果這個沉默基因是抑癌基因，那么就會引起惡性腫瘤的發生.

2.3 基因印記

H19是位于人11p15.5染色體區域的印記型基因，可能是一種與腫瘤發生呈負相關的基因。11p15.5是人類最大的基因基因簇集區域之一，近年來的研究表明H19與腎母細胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤呈現負相關[10]。 并且H19基因在高分化侵襲力弱的腫瘤細胞中不表達，而在低分化高侵襲力的腫瘤細胞中大量表達。葡萄胎中當H19基因丟失會增加惡性傾向的的發生機率[11]。Li[12] 報道了肝癌和肝胚胎瘤都有IGF2的啟動子和LOI（Loss of Imprinting）的表達異常。IGF2在我們人類有四個啟動子，其中啟動子Ⅰ是非印記基因，主要是啟動非等位基因的表達，例如人肝臟IGF2的表達。而啟動子Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是印記化基因，可以啟動單等位基因的表達，主要在胚胎期具有活性。如果成年肝臟出現P2、P3和P4的激活表達，并且伴隨LOI的出現，則與肝癌的發生密不可分。如果胚胎期的IGF2發生了LOI則大大提高了發生肝胚胎細胞瘤的可能性。由此可見基因印記的發生與其發育的不同階段對于腫瘤類型以及發生有不同的影響，也就是具有發育階段的特異性。

2.4 微小RNA

Yanaihara等[13]研究發現，肺癌腫瘤細胞與正常細胞比較有43種微小RNA的差異，28種表達下降，15種表達上升，這些變化的微小RNA大部分處于基因的缺失、擴增、轉位的高發區域。其中49%的微小RNA在復發的和沒有復發的非小細胞肺癌中出現表達差異。由此我們可知，特殊的微小RNA表達譜可以預測肺癌的預后情況。馬兆龍等[14] 利用實時定量PCR及微小RNA芯片技術檢測乙肝病毒相關性肝癌組織、乙肝肝硬化組織、人類正常肝臟細胞中的微小RNA表達譜的差異，發現乙肝相關性肝癌組織、乙肝肝硬化組織兩者與正常的肝細胞的微小RNA相比較，前兩者的表達超過正常2倍的微小RNA有6個，下調超過2倍的微小RNA有8個。與正常肝細胞相比有明顯差異的微小RNA，在乙肝肝硬化和乙肝病毒相關肝癌中在表達量上無明顯差別。故推測微小RNA表達的出現可能表明了這一病理進程：乙肝病毒感染肝硬化肝癌的必然進程，而微小RNA的表達的出現是此進程的使動因素。Kota等[15]研究表明，恢復在肝細胞肝癌中表達下調的微小RNA的表達水平可以抑制腫瘤的進一步發展。由此進一步證實了，微小RNA在惡性腫瘤發生中的重要作用

3.結語

綜上所述，DNA甲基化、組蛋白、基因印記、微小RNA等表觀遺傳修飾的異常在惡性腫瘤發生、發展中有著不可或缺的作用。由此我們可以據此對惡性腫瘤的早期診斷，治療以及預后的判斷。由于部分表觀遺傳修飾的可逆性，對于惡性腫瘤的治療，一些甲基化轉移酶抑制劑和去乙?；种苿┰谂R床中的良好的治療效果，要求我們對于各種表觀遺傳修飾與腫瘤病因之間關系仍需要進行深入研究，從而明確腫瘤發生過程中的重要靶標.更好的做好早期篩查和診斷，以及治療，為此更好地為惡性腫瘤的診斷治療提供更好的理論基礎途徑。我們相信，隨著表觀遺傳學以及惡性腫瘤等相關學科的深入研究，表觀遺傳修飾將成為惡性腫瘤篩查，早期診斷以及靶向治療提供新的科研途徑。

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第5篇：表觀遺傳學主要研究范文

隨著對白血病發病機制的深入研究及其治療方案的改進,白血病的完全緩解率也有明顯的提高,但仍有一部分患者最終會復發。近年來的研究發現, 白血病的復發與微小殘留病密切相關。微小殘留病(minimal residual disease, MRD )是指經過誘導治療達臨床緩解時，白血病患者體內殘留的少量白血病細胞。對患者進行微小殘留病監測對白血病的治療和預后判斷具有非常重要的意義。檢測MRD的關鍵是尋找分子基因標志。細胞免疫表型及遺傳學的異常改變在急性白血病MRD 檢測中占有重要地位。令人遺憾的是，這些方法只適用于少數患者，大多數患者并不具備遺傳學的預后指標。隨著對急性白血病分子生物學發病機制研究的進步，人們把急性白血病的發生歸結為抑癌基因和原癌基因通過遺傳學和表觀遺傳學機制的發生異常改變［1］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調控機制，其與腫瘤發生、發展以及檢測相關機制的研究逐步成為研究的熱點。表觀遺傳學生物標記（Epigenetic biomarkers），特別是DNA 甲基化相關標記檢測擁有遺傳學標記、抗體等標志不具備的優勢。本文就MRD細胞分子遺傳學的檢測方法及DNA甲基化檢測MRD的臨床應用進行綜述。

1 常用白血病MRD檢測方法的研究進展

1.1 分子生物學方法：遺傳學的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發生的基礎，其所導致的正?；虮磉_調控紊亂和功能異常是白血病發生的主要原因。異常的遺傳學改變，已成為急性白血病臨床檢驗資料的重要組成部分。

實時定量聚合酶鏈反應( RQ-PCR ) 方法結合了PCR和熒光探針兩種技術，通過定量檢測白血病細胞中標志性基因實時觀測MRD，是目前檢測MRD最為敏感的方法，靈敏度可達10-4-10-5，已成為臨床實驗室建立MRD檢測方法的首選。其檢測的基因標志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發展過程中比較穩定,以其作為PCR檢測MRD的分子標志具有特異性強、敏感度高的優點［2］。但是這些檢查不僅價格昂貴，其檢測的標本為RNA，存在不易保存，結果不穩定的缺點。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學基因標志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學基因標志，無法在臨床上進行MRD的檢測。即使聯合應用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當的基因標志檢測MRD，使其疾病狀態缺乏準確的判斷依據。

1.2流式細胞術( FCM)：FCM是通過檢測在正常細胞上不表達或低表達而在白血病細胞上表達或高表達的白血病相關免疫表型來定量檢測MRD，能夠準確定量殘留白血病細胞數，并且還能了解殘留白血病細胞的凋亡情況［3］。其優勢是每秒可檢測5 000～10 000個細胞,并能用計算機記錄處理,快速地對各個細胞進行多參數定量分析,靈敏度達到10- 4。但應用此法必須要對患者初發時的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當的標志檢測MRD。因為白血病細胞與正常細胞相比, 通常低達10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發展, 細胞表面的抗原發生改變, 會導致假陰性結果。

2 異常DNA甲基化檢測白血病MRD的臨床研究進展

DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉錄活性以調控基因的表達。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學改變與白血病的發生密切相關，在不改變遺傳信息的前提下導致細胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經典假說的重要補充，已成為白血病研究的新熱點。DNA異常高甲基化導致抑癌基因的失活在白血病發生發展、診斷、監測微小殘留病、預測病情以及指導治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學標志作為MRD監測標志物的臨床研究逐漸引起大家的關注。

P15基因甲基化與白血病的關系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者發生p15基因高甲基化，且持續p15基因高甲基化預示疾病復發。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］檢測了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發展為治療相關的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發生在t-MDS/AMI 早期，檢測p15甲基化有助于判斷預后、指導治療。在一組65例急性早幼粒細胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預后不良相關。

Id4和zo-1是我室新發現的兩個血液系統相關候選基因，并對其在白血病發生、復發中的作用及應用于MRD檢測進行了系列基礎與臨床研究。

采用MS-PCR的方法對完全緩解期白血病患者骨髓標本檢測id4基因甲基化狀態，結果發現：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個月內復發率為62.5%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細胞移植后的白血病患者中，5例檢測到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現復發，而11例移植后MRD持續陰性的患者無一例復發。

研究對26例完全緩解的急性白血病患者進行zo-1基因甲基化檢測，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個月內復發率為57.1%，而非甲基化的患者12個月內復發率僅為15.4%，MRD陽性病人復發率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測可能成為急性白血病新的生物標記用于預測疾病的預后以及復發。

隨著PCR 技術的進步，將實時定量PCR（real-time PCR）與MSP 結合提高了甲基化分析檢測的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對于細胞修復、腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。因此，甲基化定量PCR技術被應用與臨床各領域的研究。

Shuchi等［6］以啟動子區高甲基化狀態的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標志，采用定量甲基化特異性PCR對180例急性白血病患者骨髓標本進行檢測，結果發現：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動子區呈現高甲基化狀態的患者較低甲基化狀態的患者有更高的復發風險，而且ER-α和p15INT4B基因啟動子區甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關性。（2）對5名兒童ALL患者ER-α基因啟動子區甲基化程度進行了自誘導緩解后的追蹤檢測，結果提示疾病復發狀態較緩解狀態ER-α基因啟動子甲基化水平增加。其結果與目前常用的MRD監測標志TCR/免疫球蛋白重排水平結果基本一致。

另一研究以啟動子區高甲基化狀態的p73、p15、p57KIP2基因為MRD標志，通過對199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態（complete remission,CR）的成人ALL標本進行定量甲基化特異性PCR檢測，研究結果提示p73基因啟動子區甲基化水平與第一次CR持續時間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測有可能成為一種評估急性白血病復發風險及MRD檢測的有效手段。

結語

白血病作為一種惡性腫瘤，復發是影響其患者生存的主要問題?；颊唧w內白血病微量殘留病是復發的主要根源，對患者進行微量殘留病監測在白血病的治療和預后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數患者缺乏明確的遺傳標記作為早期檢測和準確評估MRD的標志，在臨床上常因治療不足導致疾病復發或治療過度引起嚴重并發癥，絕大多數患者在發病后1~3年內死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測和指導治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強、通用性好的分子標志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關標記，與遺傳學標記、細胞表面抗體等標志具有更多的優勢。首先，臨床常規的腫瘤標記檢測以蛋白或者RNA為對象，必須采集新鮮樣本以確定檢測結果的準確性。而甲基化檢測則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地擴展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對象，較RNA 和蛋白更穩定，更容易保存。進而保證了檢測結果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對于腫瘤預后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標，可以從另一個層面上揭示其發生機制。

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第6篇：表觀遺傳學主要研究范文

齡成為可能。作為表觀遺傳學重要組成部分的dna甲基化，在機體生長、發育、衰老的過程中存在著動態變化過程．通過

檢測dna甲基化改變，有望構建與之相關的年齡變化模式，用以推斷個體年齡。本文著重介紹dna甲基化水平的改變與

個體年齡的相關性及其在判斷個體年齡方面的前景。

【關鍵詞】法醫物證；dna甲基化；年齡推斷；生物體衰老

【中圖分類號】d9l9．2

【文獻標識碼】a

【文章編號】1007—9297(20__)04—0284—05

當前在法醫學實踐中，對個體年齡的推斷主要是

依據人類學方法測量骨骼、牙齒等一些具有年齡相關

性的檢材．并根據相關模型進行計算。分子生物學的

飛速發展，開拓了人們的視野。借助于分子生物學理

論和方法．在細胞水平、分子水平發現一些可能與年

齡相關的遺傳學改變，如dna損傷修復能力、端粒的

長度、線粒體片段的缺失、dna甲基化水平、b一半乳糖

苷酶活性以及基因表達譜等。lll dna甲基化是表觀遺

傳學(epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞

功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重

要作用．在衰老的過程中某些細胞會發生年齡相關的

變化，121例如某個cpg島的從頭甲基化會關閉一個基

因，使這個基因相關的生理功能喪失：同樣。甲基化的

丟失也會激活正常情況下沉默的基因．造成不恰當的

異位表達(ectopic expression)。必須指出，表觀遺傳研

究絲毫沒有降低遺傳學或基因組學的重要性，恰恰相

反，表觀遺傳學是在以孟德爾式遺傳為理論基石的經

典遺傳學和分子遺傳學母體中孕育的專門研究基因功

能實現的一種特殊機制的遺傳學分支學科。認識到表

觀基因組在發育、生長和衰老過程中存在著一個動態

變化的過程，以及體細胞的表觀基因組有重新編程的

可能性，有助于我們以新的觀點來探索衰老的機制，構

建年齡變化的模式。本文就dna甲基化與個體年齡的

相關性及其在判斷個體年齡方面的前景進行探討。

一

、概述

(一)表觀遺傳學和dna甲基化

遺傳學是與表觀遺傳學(genetic)相對應的概念。

遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變

化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛星不穩定等；而

表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表

達水平變化，如dna甲基化和染色質構象變化等：表

觀基因組學(epigenomics)~0是在基因組水平上對表觀

遺傳學改變的研究。甲基化是最重要的表觀遺傳修飾

形式。dna甲基化是生物體在dna甲基化轉移酶

(dnmts)的作用下，以s一腺苷酰一l一甲硫氨酸(sam)

為甲基供體，將甲基轉移到特定堿基上去的過程，

dna甲基化多發生在胞嘧啶，大多在一cpg一序列上。

胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine．

5-mc)。這種dna修飾方式并沒有改變基因序列。但

它調控了基因的表達。

哺乳動物中．cpg序列在基因組中出現的頻率僅

有l％，遠低于基因組中的其他核苷酸序列。但在基因

組的某些區域中，cpg序列密度很高，可以達均值的5

倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區．形成所謂

cpg島。通常cpg島大約含有500多個堿基。在哺乳

動物基因組中約有4萬個cpg島，而且只有cpg島

的胞嘧啶能夠被甲基化，cpg島通常位于基因的啟動

子區或是第一個外顯子區 。人類基因組中大小為

100～l 000 bp左右且富含cpg二核苷酸的cpg島總

是處于未甲基化狀態．并且與56％的人類基因組編碼

基因相關。人類基因組序列草圖分析結果表明，人類

基因組cpg島約為45 000個．大部分染色體每1 mb

就有5—15個cpg島。平均值為每mb含lo．5個cpg

島，cpg島的數目與基因密度有良好的對應關系。健

康人基因組中．cpg島中的cpg位點通常是處于非甲

基化狀態，而在cpg島外的cpg位點則通常足甲基化的。這種

甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留。閣基因

調控元件(如啟動子)所含cpg島中的5-mc會阻礙

[作者簡介]李鑫(1974一)，男，山東淄博人，主檢法醫師，碩士研究生，主要從事法醫遺傳學研究。

法律與醫學雜志20__年第l3卷(第4期)

轉錄因子復合體與dna的結合，所以dna甲基化一

般與基因沉默(gene silence)相關聯；而去甲基化

(demethylation)往往與一個沉默基因的重新激活(re．

activation)相關聯。當機體衰老或呈病理狀態，特別是

腫瘤發生時，抑癌基因cpg島以外的cpg序列非甲

基化程度增加，而cpg島中的cpg則呈高度甲基化，

以至于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。

一般說來，dna的甲基化對維持染色體的結構、x染

色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的

作用?！?】

(二)dna甲基化的生物作用及特點

1．dna甲基化與基因表達

dna甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚

胎發育過程以及衰老過程中起著極其重要的作用。研

究表明胚胎的正常發育得益于基因組dna適當的甲

基化。例如：缺少任何一種甲基轉移酶對小鼠胚胎的

發育都是致死性的。[31此外，等位基因的抑制被印記控

制區(icrs)所調控，該區域在雙親中的一個等位基因

是甲基化的。17]印記基因的異常表達可以引發伴有突

變和表型缺陷的多種人類疾病。甲基化抑制基因轉錄

主要通過以下機制來實現。

(1)直接抑制。cpg島甲基化真接干擾tf與調控

區dna 的結合． 例如camp反應元件結合蛋白

(creb)，ap一2，e2f，nfkb等tf不能與相應的dna

位點相結合。但有些tf如sp1，ctf與甲基化和非甲

基化位點都能結合，這表明甲基化單獨不足以阻止體

內tf與dna相結合。

(2)間接機制。近年來發現一些甲基化dna結合

蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化cpg結合蛋白如

mecp1，mecp2與甲基化dna特異結合，抑制基因轉

錄。其介導轉錄抑制的程度取決于甲基化密度和啟動

子的強度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的啟動

子，但對強的啟動子則收效甚微。

(3)dna甲基化還可通過影響染色體結構來抑制

轉錄。不僅甲基化啟動子區形成的核小體抑制體外起

始轉錄，而且mecp1與甲基化啟動子cpg位點結合

后，可引起染色質聚縮成非活性高級結構，以至于轉

錄因子不能與其相結合，從而抑制轉錄。

dna甲基化狀態并非固定不變．在許多哺乳動物

組織內，基因組甲基脫氧胞嘧啶水平隨老化而下降，

在鮭魚、小鼠、大鼠、牛與人類的腦、肝臟、大腸粘膜、

心臟和脾臟內發現dna脫甲基化作用。相反，大鼠肺

則不發生脫甲基化，大鼠。腎內甲基脫氧胞苷總含量增

加。這說明甲基化狀態隨老化而變化，即發生甲基化

· 285 ·

和脫甲基化，但總的說來，最常見的變化似乎是進行

性的脫甲基化。這些變化均可導致隨老化而發生的基

因表達變化。

2．dna甲基化與腫瘤的關系

研究表明，dna甲基化在腫瘤的發生、發展中起

重要作用。甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要

因素，這種變化包括dna甲基化總體水平降低和啟

動子等基因表達調控元件附近的cpg島局部甲基化

水平的異常升高，從而導致基因組的不穩定(如染色

體的不穩定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表

達)和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的

等位基因失活，則發生癌癥的幾率提高，例如：胰島素

樣生長因子一2(igf一2)基因印記丟失導致多種腫瘤，

如wilm‘s瘤。【8j

3．dna甲基化與基因印記

基因組印記是性細胞系的一種表觀遺傳修飾，這

種修飾有一整套分布于染色體不同部位的印記中心

來協調。印記中心直接介導了印記標記的建立及其在

發育全過程中的維持和傳遞，并導致以親本來源特異

性方式優先表達兩個親本等位基因中的一個．而使另

一個沉默?；蚪M印記是可遺傳的，dna的甲基化在

基因組印記的分子機理中充當重要角色。dna高甲基

化是一個基因印記抑制信號，dna甲基化對控制印記

基因中父子和母子等位基因的不同表達具有重要作

用。[91

4．人類基因組dna甲基化的特點

dna甲基化的基本特征有：1)數量多、信息容量

大；2)可遺傳性：有絲分裂時分化細胞可以穩定地將

甲基化模式傳遞給子代細胞：3)相對穩定性，即在體

內．內外環境短時間變化不會引起細胞基因組甲基化

譜的改變；4)與snp標記毗鄰，提供不同層次信息，相

互補充。人類基因組dna甲基化還有自身特點。

(1)時空特異性。dna甲基化是記錄細胞分化歷

史、維持組織特異性基因表達的主要機制之一。有學

者認為，dna甲基化可能使分化細胞基因組重新編

程，通過dna 甲基化來控制基因的時空表達，調節發

育過程和各種生理反應。在不同組織或同一類型細胞

的不同發育階段，基因組dna上各cpg位點甲基化

狀態的差異構成基因組dna甲基化譜。組織特異的

dna甲基化譜是哺乳動物基因組的一個顯著特征。

細胞之間dna甲基化模式的差異是在個體發育

的過程中逐步形成的，并在以后的有絲分裂中保持不

變。在胚胎發育過程中，細胞的甲基化模式按一定方向

發生有規律地變化。成年個體，組織特異性基因形成組

· 286 ·

織特異性的甲基化模式。隨著年齡增長，基因組dna甲

基化總體水平不斷下降．特定dna片斷的甲基化程度

可以增高或降低。取決于組織細胞和基因種類。

(2)親緣特異性。在某些基因座，所有組織體細胞

都選擇性地將親代一方的等位基因甲基化．呈現親緣

依賴的等位基因甲基化模式。

(3)病理特異性。在病理狀態下，組織細胞的dna

甲基化譜發生特異性的改變。dna甲基化改變在許多

腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用。目前證實，啟

動子高甲基化是腫瘤抑制基因第三種常見的失活途徑。

二、dna甲基化與年齡相關性

分化細胞的穩定性是高等生物的基本特征之一。

然而，在衰老過程中某些細胞會發生年齡相關的變

化。例如，某種cpg島的從頭甲基化會關閉一個基因，

喪失與這個基因相關的生理功能；同樣．甲基化的喪

失也會激活正常情況下沉默的基因，造成不恰當的異

位表達。2o世紀8o年代初，wilson等測定了體外培養

的人、田鼠及小鼠成纖維細胞dna的5 甲基胞嘧啶

含量，發現均隨細胞分裂次數的增加而降低．且下降

速度以人、田鼠、小鼠的次序遞減．而永生化細胞系的

5 甲基胞嘧啶含量則保持相對穩定。以dna甲基化

酶抑制劑5 氮雜胞苷或5 氮脫氧胞苷處理人二倍

體成纖維細胞或某些腫瘤細胞，可使其增殖能力下

降，體外培養壽限縮短。因此，dna甲基化水平也可以

作為細胞分裂的“計時器”。體內實驗同樣發現基因組

整體甲基化水平有隨齡降低的趨勢。

在基因組整體甲基化水平降低的同時，衰老過程

中也伴有個別基因甲基化水平增高的現象。最早證明

與年齡相關啟動子cpg島的甲基化是人結腸組織雌

激素受體(estrogen receptor，er)基因，年輕個體中，幾

乎檢測不到er基因的甲基化，以后，隨齡逐漸升高。

另外。胰島索樣生長因子2(insulinlike growth facror，

igf2)、肌原調節蛋白myod1、體覺誘發電位組分

n33基因啟動子cpg島的甲基化水平在正常的結腸

組織中同樣隨齡升高。tra等用限制性界標基因組掃

描技術對t淋巴細胞20__個基因座的甲基化年齡變

化情況進行了調查，發現29個基因座有變化，其中23

個增加，6個降低。也許．這些特定基因的甲基化是更

好的衰老生物學標志。

陳培利等_10]利用人胚肺二倍體成纖維細胞(hu

man fetal lung diploid fibroblasts。2bs)進行體外培養。

發現其p16基因啟動子區及外顯子i處的dna甲基

化水平隨個體細胞代齡的增加而降低。他們首先將

2bs細胞在體外作常規傳代培養(規定3o代齡以內為

法律與醫學雜志20__年第l3卷(第4期)

年輕細胞，55代齡以上為衰老細胞，在31至54代齡

之問位中年細胞)。然后用有機法提取細胞dna，取各

組dna各llxg加入sinai約40u，25~c酶切過夜(smai

不具備甲基化修飾作用)。然后對p16基因外顯子i

及13-actin進行pcr擴增。

ll 二| ’。_ lll

l | _ __?一_l＼

‘l ＼_ _l’ _li ＼

_l＼ il 、

l i、

4 _ li 0_ _l

年輕細胞中年j田胞老年細胞

圍1不同代齡2bs細胞p16外顯于pcr擴增條帶的吸光度掃描值【’。

寰1 不同代齡2bs細胞pl6外丑于l殛i~-actinpcr擴增條帶的吸

光度掃描值

組別 n

灃：#以b—actin的值校正后結果；t檢驗，與年輕細胞相比， p<o．05

實驗結果(參見表1)表明，不同代齡2bs細胞

p16基因外顯子i上的擴增產物均低于相對的未酶切

的b—actin對照組，且其dna甲基化水平隨代齡的增

加而趨于降低，在年輕細胞中甲基化水平約為64％．

而在衰老細胞中僅為24％，降低約40％。在之后的研

究中，陳培利等在以2bs為模型的衰老研究中發現，

細胞分裂一次端區(即端粒)縮短50bp，抑制dna甲

基化則可導致細胞早衰。?】他們測定了去甲基化處理

后的2bs細胞的端區長度．研究表明老年2bs細胞衰

老表型更加明顯，端區長度較對照細胞縮短，而年輕

細胞則變化不顯著。從而推斷甲基化的改變可以影響

染色質的構象，從而可能改變端區結合蛋白與dna

的作用l1 1，后者可以進一步引起端區長度改變。

三、dna 甲基化檢測方法

隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化

檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。

dna甲基化可以從甲基化含量、甲基化水平、甲基化

模式和甲基化圖譜分析等多種途徑進行分析。甲基化

含量分析5mc在基因組中所占的總體比例：甲基化水

2 1 8 6 4 2 0

l n n

瓔輟 越

法律與醫學雜志20__年第13卷(第4期)

平分析單個cpg胞嘧啶甲基化的發生率，若同時分析

多個cpg位點，則可以制作甲基化水平圖譜；甲基化模

式分析一段單鏈dna上一組cpg的甲基化狀態組合。

根據研究目的，甲基化檢測方法分為：基因組整體水平

的甲基化檢測，特異位點甲基化的檢測和尋找新甲基化

位點。從研究所用的處理方法不同分為：基于pcr的甲

基化分析方法；基于限制性內切酶的甲基化分析方法；

基于重亞硫酸鹽的分析方法和層析法等。[31以下歸納

總結了主要的甲基化分析方法以及相關特性。

(一)基因組整體水平甲基化分析

高效液相色譜柱(hplc)及相關方法。hplc是一

種比較傳統的方法，能夠定量測定基因組整體水平

dna甲基化水平。它由kuo等1980年[131首次報道。

過程是將dna樣品先經鹽酸或氫氟酸水解成堿基，

水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光

測定吸收峰值及其量，計算5mc／(5mc+5c)的積分面

積就得到基因組整體的甲基化水平。oefner等1992

年提出變性高效液相色譜法(dhplc)用于分析單核

苷酸和dna分子。鄧大君等20__年i141將其改進與

pcr聯用建：立了一種檢測甲基化程度的dhplc分析

方法。將重亞硫酸鹽處理后的產物進行差異性擴增。

由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時仍被保留為胞

嘧啶，因此原甲基化的在pcr擴增時，其變性溫度也

相應上升。使pcr產物在色譜柱中保留的時間明顯延

長．這樣就可以測定出pcr產物中甲基化的情況。

這種方法的最明顯優點是：可用于高通量混合樣

本檢測．能夠明確顯示目的片段中所有cpg位點甲基

化的情況．但不能對甲基化的cpg位點進行定位。

其他基因組水平甲基化分析還有sssi甲基轉移

酶法，免疫化學法，氯乙醛法等。各具優缺點。

(二)特異性位點的dna 甲基化的檢測

1．甲基化敏感性限制性內切酶(ms—re—pcr／

southern)法

這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲

基化區的不切割的特性．將dna消化為不同大小的

片段后再進行分析。 這是一種經典的甲基化研究方

法，其優點是：相對簡單，成本低廉，甲基化位點明確，

實驗結果易解釋；

2．甲基化特異性的pcr(ms—pcr)

herman等[161 1996年在使用重亞硫酸鹽處理的基

礎上新建的一種方法。它將dna先用重亞硫酸鹽處

理。這樣未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化

的不變。隨后行引物特異性的pcr。檢測msp擴增產

物．如果用針對處理后甲基化dna鏈的引物能擴增

· 287 ·

出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；若用針對

處理后的非甲基化dna鏈的引物擴增出片段．則說明

被檢測的位點不存在甲基化(見圖2)。[15·17]

． ／

5’衄_{2盈__ 平 盈3． 5-啪__曩墨|_唧h _霉疊__甲3·

— __． —

p1．m ri 一 一

圖2甲基特異性的pcr擴增(ms—pcr)示意i莩i。dna經重亞硫酸鹽處

理后。以處理后的產物作為模板．加入甲基化特異性的引物(primer 1)

或非甲基化的引物(primer¨)．進行特異性的擴增(如圖所示)，只有結

合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產物。[1s,1

(三)尋找新甲基化位點

1．限制性標記基因組掃描(rlgs)

costello等20__年報道的rlgs[ 81能對整個基因

組的甲基化狀態進行分析．發現新甲基化基因的方

法。這種方法聯合使用了限制性內切酶及二維電泳。

其過程是：先用甲基化敏感的稀頻限制性內切酶not

i消化基因組dna，甲基化位點保留，標記末端、切

割、行一維電泳，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的

內切酶切割。行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割

開并在電泳時顯帶，得到rlgs圖譜與正常對照得出

缺失條帶即為甲基化的可能部位。

2．聯合甲基化敏感性限制性內切酶的mb(com．

pare—ms)

srinivasan yegnasubramaniant 91 20__年報道了一

種新方法compare—ms．該法將mbd柱層析法與

ms—re聯用?；パa了各自單用的弊處，能夠快速、敏感

的檢測dna甲基化情況(見圖3)。[19j

四、甲基化型分析的優勢以及存在的問題

(一)甲基化作為檢測對象的優勢

1．甲基化型既能反映有關基因功能狀態及與此相

連的多種疾病相關的豐富信息。叉具有簡單的“二元

化”性質，即令甲基化為“0”，非甲基化為“1”，就可以進

行數字化處理，便于開展大規模和自動化監測分析。

2．dna分子十分穩定。有可能將它和dna的snp

分析等置于同一個技術平臺。同時它又比rna和蛋白

質更便于保存和運輸。并可對已經石蠟、甲醛或乙醇預

· 288 ·

_f 簟

圖3 聯臺甲基化敏豫性限制性內切酶的mbd (compare-ms)示

意圍。用甲基化以外的位點的內切酶ia酶)與甲基化敏雅的內切酶(b

酶)聯用．則甲基化的dna鏈不被切開。非甲基化的切開．再行mbd

捕獲存在甲基化位點的dna片段。最后行實時pcr擴增并分析。f刪

處理的樣本進行分析，可以開發歷史上儲備的病理學資

料。

(二)存在的問題

目前還未找到dna甲基化改變與年齡之間的精

確的量化關系式。雖然人們對個體細胞的衰老及其基

因甲基化水平的改變有了初步的了解．但還在研究探

索二者之問的精確的量化關系。[201對使用dna甲基

化改變來推斷個體年齡的大小，仍需要進行大量的研

究和調查。

(三)付諸于實踐之前還必須解決的問題

1．確定表觀遺傳修飾與特定生理指標的相關性：

2證實將這些指標作為鑒別診斷的潛在可能性和

技術可行性：

3．通過一定規模的流行病學調查來驗證實驗室內

的表觀遺傳生理及病理發現在人群中的真實性。

五、dna甲基化在法醫學中判定個體年齡上的展

望

目前，研究dna甲基化水平改變與個體年齡的

相關性尚處于試驗階段，但已引起許多學者的關注。

人類表觀基因組協會(human epigenome con—sortium，

hec)于20__年1o月正式宣布開始投資和實施人類

表觀基因組 計劃(human epigenome project，hep)。

dna甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的

重要研究內容，hep的最終目標是就要確認這些dna

甲基化位點在人類基因組的分布與頻率，以指導和系

統研究dna甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發育、基因

印記等發揮的作用。 借助于該計劃的實施和分子生

物學技術的發展，在法醫實踐中可以通過調查各年齡

段人群基因組dna甲基化分布以及相關頻率，建立

相關統計學模型，將來有望成為法醫個體年齡判定的

一項重要的生物學指標。(感謝西安交通大學醫學院第一附

法律與醫學雜志20__年第l3卷(第4期)

屬醫院婦產科、環境與疾病相關教育部重點實驗室鄭鵬生教授

和顧婷婷同學的支持和幫助。)

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第7篇：表觀遺傳學主要研究范文

[關鍵詞] Beckwith-Wiedemann綜合征；表觀遺傳學；DNA甲基化；印記基因；Wilms腫瘤

[中圖分類號] R726.5 [文獻標識碼] C [文章編號] 1673-9701（2016）26-0155-03

表觀遺傳學是近年來醫學研究的新熱點，而Beckwith-Wiedemann 綜合征（BWS）是研究表觀遺傳學的代表性疾病之一。本病是一種罕見的先天性印記基因表達異常綜合征，印記基因最具特征的標志是DNA 獲得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 號的染色體短臂15.5 區域，以臍膨出、巨大舌和身體的一側生長過剩為主要表現，臨床上還可見短暫性低血糖、面部鮮紅斑痣、內臟肥大、腫瘤等其他表現。本文通過介紹我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 綜合征患兒情況，以提高臨床醫生對本病臨床表現、診斷、發病機制的認識，現報道如下。

1 病例資料

患兒，女，36+1周早產，于2014年9月25日9：35于我院產科出生，患兒系第1胎第1產，順產，其母胎膜早破5 h，產前無宮內窘迫，生后Apgar評分1 min、5 min均為10分，出生體重3600 g，羊水、臍帶未見異常，胎盤大，生后發現患兒舌大伴吐舌，為進一步治療轉入我科。

母孕史：其母孕期規律產檢，孕29周時宮內B超提示胎兒雙腎增大，孕34周時宮內B超提示胎兒巨舌癥？家族史：父母體健，非近親結婚，否認家族遺傳病病史及中毒、外傷史。

入院查體：體重：3550 g，身長：50 cm，頭圍：33 cm，神清，精神反應可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭聲響亮，婉轉有調，顏面可見紅斑，前囟平軟約1.5 cm×1.5 cm，左頂部可觸及2 cm×2 cm×3 cm血腫，心音有力，律齊，心前區未聞及雜音，兩肺呼吸音清，腹軟，腹正中劍突下至臍部可見一條狀隆起，哭鬧時明顯，臍根部粗大，肝肋下2 cm，質軟邊銳，脾肋下未及，雙側肢體對稱，無偏身肥大，四肢肌張力正常。

輔助檢查：血尿便常規無異常，血生化無異常，TORCH（-），血胰島素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超聲心動圖：房間隔缺損3 mm，繼發孔型。腹部B超：肝臟增大，雙腎增大，雙側腎盂分離。

小兒外科：臍疝，腹白線疝。皮膚科：面部鮮紅斑痣?？谇豢疲荷囿w良性肥大。

診治經過：入院第2天出現血糖偏低（2.5 mmol/L），經喂養糖水及奶、靜脈輸入葡萄糖，血糖恢復正常。住院期間每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，經加強喂養后血糖正常。

出院后隨訪：出生后40 d，混合喂養，血糖監測正常。右側肢體較左側偏大（右上肢、下肢較左側長0.5 cm，右下肢較左側粗0.5 cm），活動好，肌張力正常，用力時腹中線部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA結果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的單親二倍體。

2 討論

2.1 發病率及病因

第8篇：表觀遺傳學主要研究范文

【關鍵詞】 輔助生殖技術；妊娠早期；染色體異常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年來， 助生殖技術（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治療不孕問題， 相關研究顯示[1]， 發達國家每年有≥3%的輔助生殖技術出生兒， 輔助生殖技術為不孕家庭帶來了福音。自然流產是一種人類優勝劣汰的自然選擇結果， 發生自然流產的幾率為15%， 在全部流產中占75%的比例， 導致自然流產的主要原因是染色體異常（夫妻染色體異常與胚胎染色體異常）。近30年來， 輔助生殖技術得到了高速發展， 但有相關報道指出[2， 3]， 輔助生殖技術致早期妊娠流產率較高， 為此， 本院對400例流產患者進行了絨毛細胞分離和染色體分析， 現做如下報告。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流產患者400例， 將其中320例自然妊娠孕早期自然流產患者作為對照組， 80例因輔助生殖技術致妊娠的孕早期自然流產患者作為觀察組。觀察組患者年齡22～43歲， 平均年齡（33.6±3.3）歲， 孕周7～12周；對照組患者年齡25～44歲， 平均年齡（31.2±5.2）歲， 孕周7～12周。兩組患者一般資料比較， 差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。在告知兩組患者實驗過程及目的后， 均表示愿意參加實驗并簽署知情同意書， 實驗獲得了醫院倫理委員會批準同意。

1. 2 方法 先提取絨毛細胞， 對流產的患者進行子宮清宮術， 備好負壓吸引管， 清宮時嚴格遵守無菌操作規程， 采用負壓吸引管利用負壓原理， 吸附絨毛組織5～20 mg。將這5～20 mg絨毛組織作為標本， 放入生理鹽水中浸泡， 并立即送入中心實驗室備檢。標本送達后， 立對絨毛組織標本進行分離培養， 采用雙抗清洗法清洗標本， 去污物（血塊、蛻膜組織）， 保留典型的絨毛組織約10 mg， 將清洗后的標本放入離心管置入離心機進行離心操作， 離心結束后觀察管內分層， 去除上層的液體， 在下層滴入生物酶（膠原酶、胰酶）， 將標本放入保溫箱， 仔細觀察并記錄， 待出現絨毛散開現象時， 立即滴入母牛血清， 采用電子顯微鏡觀察絨毛細胞形態。當視野中出現成片狀細胞， 將標本放入新鮮的培養液中并滴入生物堿（秋水仙素）， 再次放置在保溫箱內， 放置時間為4 h， 然后去掉上層清夜， 將標本置入水浴箱， 2 h后取出， 將標本放入離心機再次離心， 將離心后的標本去上清液制成懸液， 通過萊卡顯微鏡進行觀察， 選擇兩名醫生同時讀標本玻片， 每例計算20個分裂象， 分析2個核型（嵌合體加倍計數）。

1. 3 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P

2 結果

觀察組患者中

3 討論

輔助生殖技術是治療不孕不育的一種手段， 有體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子體外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根據WTO的相關數據顯示[5-9]， 我國的不孕癥發病率高達15%， 傳統的治療遠遠不能滿足日益增長的不孕不育患者的治療需要。

自然流產是妊娠過程中常見的并發癥， 而染色體異常則是自然流產的主要原因之一， 包括夫妻染色體異常和胚胎染色體異常[10-12]。夫婦染色體異常常見的有平衡易位和羅伯遜易位， 胚胎染色體異常常見的有三倍體、多倍體及染色體平衡易位、嵌合體等。與自然流產相比， 輔助生殖技術妊娠不增加妊娠早期流產率， 但是與流產孕婦的年齡存在著一定的關系。本研究通過對流產的患者進行子宮清宮術， 清宮時采用負壓吸引管利用負壓原理， 取出絨毛組織5～20 mg作為實驗標本， 將其放入生理鹽水中浸泡， 然后對絨毛組織標本進行分離培養， 采用雙抗清洗法清洗標本， 去除血塊及蛻膜組織， 保留典型的絨毛組織， 進行離心操作， 觀察標本現象。發現自然妊娠孕早期自然流產患者的絨毛細胞染色體異常率與輔助生殖技術致妊娠早期自然流產患者的絨毛細胞染色體異常率無明顯差異（P>0.05）， 但是不同年齡間差異具有統計學意義（P

相關研究顯示[2]， 輔助生殖技術能影響表觀遺傳（印記基因）的調控， 影響胚胎植入和胎兒生長等， 表觀遺傳學方面的異常能使胚胎停育， 基因印記缺陷會導致早期妊娠的不穩定易發生流產[1]?？刂菩哉写倥怕堰^程中， 大劑量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印記異常， 輔助生殖技術實施時間正處于印跡重建的窗口期， 運用于當中的操作會對配子及胚胎的甲基化狀態發生一定的影響。

本文研究結果顯示， 觀察組患者中

綜上所述， 輔助生殖技術并不增加妊娠早期流產胚胎染色體異常的發生率， 但絨毛細胞染色體異常與育齡婦女的年齡有明顯的關系， 年紀≥40歲的患者采用輔助生殖技術妊娠更容易導致妊娠早期流產。

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第9篇：表觀遺傳學主要研究范文

【摘 要】目的：研究小鼠早期胚胎各發育階段組蛋白H3K4單和雙甲基化的變化過程。方法：準備受孕母鼠，獲取小鼠各階段正常早期胚胎，通過4%多聚甲醛固定，0.4%triton透膜，0.1%牛血清白蛋白封閉，抗H3K4單雙甲基化一抗染色處理，二抗避光孵育后，利用免疫熒光技術，對各個階段早期胚胎組蛋白H3K4單和雙甲基化表達水平鑒定。結果：成功得到所需要的各發育階段的正常早期胚胎。發現：從1細胞胚胎到8細胞胚胎組蛋白H3K4單和雙甲基化表達水平整體呈下降趨勢，在1細胞胚胎達到最高，8細胞胚胎表達水平最低，桑葚胚和囊胚較8細胞胚胎表達水平又有所回升。結論：在早期胚胎發育過程中，組蛋白H3K4單和雙甲基化程度成逐漸下降趨勢。

【關鍵詞】小鼠早期胚胎；組蛋白H3K4；甲基化；表觀遺傳修飾

表觀遺傳是指DNA序列不發生變化但基因表達卻發生了可遺傳的改變［1］。這種改變是細胞內除了遺傳信息以外其他可遺傳物質發生的改變,即基因型未發生變化而表型卻發生了改變,且這種改變在發育和細胞增殖過程中能穩定傳遞［2-3］。其修飾方式主要有DNA甲基化，去甲基化和組蛋白乙?；?。它們對于早期胚胎和配子的形成和發育、組織特異性基因的表達、大部分基因沉默(gene silencing)起關鍵作用，在正常細胞過程，比如雌性哺乳動物X染色體失活，以及酵母中配對型位點的沉默方面也有重要作用［4］。

組蛋白修飾是表觀遺傳學里主要修飾方式之一，到目前為止，在組蛋白上至少發現有八種不同的修飾方式，我們了解比較多的是乙?；?、甲基化和磷酸化這樣比較小的共價修飾。近幾年的研究發現，H3K9的甲基化與基因的沉默有關，而H3K4的甲基化卻可以使基因活化且H3K4的甲基化可招募HP1或其同源物與之結合，從而使基因所在部位異染色質化，這表明，組蛋白的甲基化可能與異染色質的形成有關［9-11］。H3K4位點發生的甲基化可以激活基因的轉錄，其必須在H2B的123位賴氨酸呈現泛素化的狀態下進行，根據以往研究表明，H3K4甲基化可能是轉錄發生的早期事件，由于這種修飾在多細胞動物中是異常復雜的，因此研究H3K4單和雙甲基化的具體功能更具有重要的意義。

本實驗中，我們研究了組蛋白H3K4單和雙甲基化對小鼠早期胚胎各階段動力學變化過程, 有助于揭示表觀遺傳學對哺乳動物早期胚胎基因表達、調控、遺傳的重要作用。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗試劑：孕馬血清（PMSG）,購自寧波激素制品廠；人絨毛膜促性腺激素（HCG，寧波激素制品廠）；胰酶消化液（Sigma）；4%多聚甲醛（Sigma）；0.4%triton（Sigma）；0.1%BSA(牛血清白蛋白)；一抗（兔抗鼠H3K4單和雙甲基化，Abcam）；二抗（羊抗兔，Santa cruz）；PBS磷酸緩沖液。

1.3 小鼠的超數排卵及：選擇6～8周齡健康昆白小鼠，并進行光照控制：6：00～ 2O：O0光照，2O：O0～6：00黑暗。16：00-17：OO時雌鼠腹腔注射PMSG10IU(寧波激素制品廠)，48h后再注射hCG10IU(寧波激素制品廠)，然后將其與雄鼠2：l合籠。次日早上8點之前檢查陰道栓，有乳白色或者黃色凍膠物（陰道栓）即確定為懷孕，見栓當天上午確定為懷孕0.5天。同樣方法取分別懷孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠進行實驗。

1.4 小鼠早期胚胎的獲?。喝》謩e懷孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠，將母鼠置于超凈工作臺上，對其進行斷頸處理，用手術剪剪開腹部，暴露子宮。用鑷子和細針將子宮連同卵巢同其余組織分離，然后置于盛有PBS的培養皿內。用無鈣鎂PBS洗滌3次，棄除表面殘余血跡。將培養皿置于倒置顯微鏡下，用細針分離卵巢和子宮周圍的脂肪組織。1細胞的獲?。河描囎庸潭ㄗ訉m一端，取細針戳破輸卵管的壺腹部，暴露1細胞，用自制吸取胚胎工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。2-8細胞的獲取：剪去卵巢，用鑷子固定子宮一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宮，沖洗輸卵管，待胚胎被PBS液沖出后，用工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。桑葚胚，囊胚的獲?。杭羧ポ斅压芎吐殉?，用鑷子固定子宮一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宮，沖洗子宮，待胚胎被PBS液沖出后，用工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。

1.5 染色與細胞組蛋白H3K4甲基化的檢測：除1細胞需經過胰蛋白酶消化去掉胚胎上的顆粒細胞外，其余都同下步驟。用4%多聚甲醛固定胚胎30分鐘，然后用 0.4%triton 透膜20分鐘, 再用0.1%牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘，每個步驟結束后都需要用PBS液清洗三遍，每次二分鐘。之后加一抗（兔抗鼠抗H3K4單或雙甲基化）4℃放置過夜，第二天上午用PBS液清洗干凈后再加帶有熒光標記的二抗（羊抗兔FITC）避光孵育1小時。熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 實驗結果

2.1 組蛋白H3K4單和雙甲基化修飾免疫熒光染色：檢測早期胚胎（1細胞至囊胚）H3K4單甲基化表達水平（圖1）

根據染色強度繪制出相對熒光強度曲線（圖2）。

從圖1和圖2可以觀察出，組蛋白H3K4修飾在早期胚胎階段大致上呈下降趨勢，在1細胞-8細胞期間較為明顯，在1細胞維持較高水平，到8細胞階段，其表達水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達水平又稍有所提高。

2.3 組蛋白H3K4雙甲基化修飾免疫熒光染色

同時檢測早期胚胎（1細胞至囊胚）H3K4單甲基化表達水平（圖3）。根據染色強度繪制出相對熒光強度曲線（圖4）。

從圖3和圖4可以觀察出，在小鼠早期胚胎發育的整個早期過程中，組蛋白H3K4修飾在早期胚胎階段大致上呈下降趨勢，在1細胞維持較高水平，到8細胞階段，其表達水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達水平又稍有所提高。但是與單甲基化修飾相比，亦可以發現，雙甲基化修飾的熒光信號強度要高于單甲基化，也就是說，對于組蛋白H3K4而言，雙甲基化比單甲基化更容易發生在早期胚胎中。

3 討論

組蛋白H3第4賴氨酸的甲基化作為共價修飾的方式之一, 可以發現H3K4甲基化是組蛋白修飾中的一個非常重要的方式,與基因的轉錄調控有關,與多種癌癥的發生發展關系密切,現已成為表觀遺傳學研究的熱點。雖然體細胞克隆技術已經在多種動物中得以實現,但克隆胚胎懷孕率低、出生后異常等問題,嚴重制約了體細胞克隆技術的開發應用。有研究證實,供體細胞核在受體卵母細胞中不完全或異常的表觀遺傳重編程是導致克隆胚胎發育異常的重要原因。組蛋白的共價修飾是重要的表觀遺傳修飾,具有復雜而廣泛的生物學功能。在正常生殖細胞發生和胚胎發育過程中,染色體要經歷廣泛的DNA甲基化、去甲基化,核小體核心組蛋白也要通過各種共價修飾調節染色體功能,從而完成遺傳信息的傳遞和調控胚胎的發育［15］。目前,我們對早期胚胎組蛋白H3K4表達水平的動力學變化過程還不是很清楚。本實驗對此進行了較為系統的研究。

結果發現早期胚胎階段組蛋白H3K4單和雙甲基化表達大致呈下降趨勢，（圖2，圖4所示）在1細胞-8細胞期間較為明顯，但在8細胞階段，其表達水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達水平又稍有所提高。結果推斷，組蛋白甲基化信號在在1細胞時期維持了較高的水平，隨著胚胎的發育和分裂分化，由于配子本身基因的表達，使組蛋白甲基化的程度越來越低。本實驗的研究結果可加深早期胚胎組蛋白修飾的重編程,為改善克隆效率提供理論依據。

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